药物补硒的方法有哪些呢（药用补硒）

本发明涉及一种硫酸软骨素纳米硒在制备治疗认知功能衰退相关神经系统疾病的药物中的应用。属于医药技术领域。

背景技术：

硫酸软骨素(chondroitinsulfate，cs)是一种存在于细胞外基质中的硫酸糖胺聚糖。cs具有多种生物活性，如抗炎、抗氧化、神经保护和抗神经炎症等。cs通常附着在蛋白核心上，形成硫酸软骨素蛋白聚糖(cspg)。cspgs主要分布于神经元周围的基质中，参与神经系统损伤后的神经形成、迁移、轴突生长和引导、突触可塑性和再生。cs通过激活蛋白激酶c(pkc)，减少活性氧的形成，保护氧化应激条件下的sh-sy5y细胞。cs还能抑制aβ的纤维形成，阻断aβ诱导的细胞活力丧失和凋亡，降低细胞内游离钙浓度和caspase-3蛋白表达，减轻aβ诱导的体内外神经毒性。此外，cs还能降低肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、环氧合酶-2(cox-2)和诱导型一氧化氮合酶(inos)的表达，防止nf-κb/p65核移位，进而抑制脂多糖诱导的神经炎症。

硒(se)是人体所必需的微量营养素，在解毒、调节细胞氧化还原稳态和免疫系统保护等方面发挥着重要作用。近年来，硒和硒蛋白在包括ad在内的神经退行性疾病中的作用已经有了大量的研究。硒能有效抑制aβ纤维的形成，并能将预先形成的aβ纤维分解成无毒的聚集体。此外，动物实验也表明神经递质代谢与体内硒的水平改变有关。然而，无机硒毒性大，安全剂量为400μg/天，且无机含硒物质的有效剂量与中毒剂量相差不大，服用过量可引起中毒。有机纳米硒的毒性比无机硒低，生物活性比无机硒高，可以作为一种有效的补硒剂。

专利cn102145174b公开了一种硫酸软骨素纳米硒及其制备方法，以硫酸软骨素、亚硒酸盐或硒代硫酸盐为原料，通过维生素还原制备了硫酸软骨素纳米硒；专利cn107260668a公开了一种硫酸软骨素a纳米硒胶束离子及其制备方法和应用，以硫酸软骨素a为载体，将纳米硒吸附结合在硫酸软骨素a上形成硫酸软骨素a纳米胶束。上述两个专利对硫酸软骨素纳米硒拮抗t-2毒素诱导的软骨细胞凋亡进行了初步研究。

技术实现要素：

本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种硫酸软骨素纳米硒在制备治疗认知功能衰退相关神经系统疾病的药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

硫酸软骨素纳米硒在制备治疗认知功能衰退相关神经系统疾病的药物中的应用。

优选的，所述硫酸软骨素纳米硒是通过以下方法制备得到的：取na2seo3、硫酸软骨素溶于40ml去离子水中，逐滴加入50mml-半胱氨酸(l-cys)溶液，30℃磁力搅拌1.5小时；mwco1000透析袋对水透析24小时后(每3小时换水一次)，冷冻干燥得硫酸软骨素纳米硒；其中，na2seo3、硫酸软骨素、l-半胱氨酸溶液中所含l-半胱氨酸的摩尔比为1：1～4：1～4。

进一步优选的，na2seo3、硫酸软骨素、l-半胱氨酸溶液中所含l-半胱氨酸的摩尔比为1：1～3：1～3。

进一步优选的，所述硫酸软骨素选自猪硫酸软骨素、牛硫酸软骨素、鲨鱼硫酸软骨素、鸡硫酸软骨素、鸭硫酸软骨素、乌贼硫酸软骨素、鲟鱼硫酸软骨素、鳗鱼硫酸软骨素、鳐鱼硫酸软骨素、魟鱼硫酸软骨素中的任一种或几种。

优选的，所述认知功能衰退相关神经系统疾病为β-淀粉样蛋白、冈田酸、脂多糖、alcl3中的一种或者几种诱导产生。

本发明的有益效果：

本发明结合了硫酸软骨素和纳米硒的优点，制备得到的硫酸软骨素纳米硒，有效降低了无机硒的毒性，具有抑制aβ聚集，减轻氧化应激反应等多重药理活性，可用于制备治疗认知功能衰退相关神经系统疾病的药物。具体如下：

1.本发明所提供的硫酸软骨素纳米硒，以硫酸软骨素为纳米硒修饰剂和稳定剂，所形成的硫酸软骨素纳米硒稳定性好，细胞毒性低，抑制aβ1-42聚集，对aβ1-42诱导神经细胞损伤的具有良好保护作用。

2.本发明所提供的硫酸软骨素纳米硒，可显著降低肌动蛋白细胞骨架不稳定性，保护sh-sy5y细胞免受冈田酸诱导的肌动蛋白细胞骨架结构的改变。

3.本发明所提供的硫酸软骨素纳米硒，可降低细胞内活性氧(ros)和丙二醛(mda)含量，提高gsh-px水平，拮抗氧化应激对细胞的损伤；且其抗氧化应激损伤效果远好于同剂量的纳米硒和硫酸软骨素。

附图说明

图1为cs@se对aβ1-42纤丝形成的抑制作用，其中，a、b、c、d、e分别为终浓度100μmaβ1-42，100μmaβ1-42+25μg/mlcs@se，100μmaβ1-42+50μg/mlcs@se，100μmaβ1-42+48.55μg/mlcs，100μmaβ1-42+1.45μg/mlnano-se，37℃孵育72h。

图2为cs@se对aβ1-42聚集的抑制作用。

图3为cs@se对冈田酸引起的sh-sy5y细胞f-肌动蛋白损伤的影响，其中，a、b、c、d、e、f分别为空白、aβ1-42、aβ1-42+25μg/mlcs@se，100μmaβ1-42+50μg/mlcs@se，100μmaβ1-42+48.55μg/mlcs，100μmaβ1-42+1.45μg/mlnano-se。

图4为cs@se对aβ1-42引起细胞内氧化应激损伤的影响，其中a、b、c分别为ros、mda、gsh-px。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1硫酸软骨素纳米硒的制备

取100mmolna2seo3、200mmol鲨鱼cs(na2seo3：cs摩尔比＝1：2)溶于80ml去离子水中，逐滴加入50mml-半胱氨酸(l-cys)溶液(na2seo3：l-cys摩尔比＝1：2)，30℃磁力搅拌1.5h。mwco1000透析袋对水透析48h后(每2h换水一次)，冷冻干燥得粉红色的硫酸软骨素纳米硒。

实施例2cs@se对aβ纤丝结构的影响

取1mgaβ1-42溶于2.216ml无菌水后经0.22μm微孔滤膜过滤，得到100μmaβ溶液，备用。取aβ溶液加入终浓度为cs@se(25μg/ml和50μg/ml)，cs(48.55μg/ml)，nano-se(1.45μg/ml)溶液，空白对照组为100μm的aβ1-42。然后将样品置于37℃孵育3天，取样进行电镜观察实验，将样品滴加到200目formvar-包被的铜网上，25℃干燥1min，用质量浓度2％磷钨酸负染，aβ1～42纤丝形态采用jem-1400透射电镜观察cs@se对aβ纤丝结构的形成的影响。结果如图1所示，采用透射电镜观察了cs@se对aβ纤维超微结构的抑制作用，aβ1-42样品在没有cs@se的情况下孵育72h，形成了具有淀粉样蛋白特征的大的分支纤维。而在cs@se(50μg/ml和25μg/ml)以及cs(48.55μg/ml)存在下，aβ1～42聚集体发生了明显的变化，其中以非晶态低聚物为主，短纤维可忽略不计，且同等剂量下cs@se对aβ1-42的聚集的抑制作用明显强于单独的cs和nano-se。cs@se可能通过抑制蛋白质的自然状态(如单体和非晶态寡聚体)来抑制aβ1-42的聚集。(图1)

实施例3cs@se对aβ1-42聚集的抑制作用

为了表征cs@se对aβ1-42聚集的抑制作用，利用tht荧光染料与aβ1-42纤维结构特异性结合特点考察了aβ1-42的聚合动力学。aβ1-42溶液(100μm)与cs@se(25μg/ml和50μg/ml)、cs(48.55μg/ml)，nano-se(1.45μg/ml)在37℃条件下避光孵育72h，不同的时间点(0h、10h、24h、48h、72h、100h)取出30μlaβ1-42溶液与400ultht(15μm)溶液混合，室温避光孵育30min后荧光分光光度计测定其荧光强度。激发波长440nm,发射波长480nm，狭缝宽度20nm。结果如图2所示，当aβ1-42孵育72h后，aβ1-42的动力学生长曲线呈半s形，与之前文献报道的研究结果一致。cs@se(25μg/ml和50μg/ml)的存在下，aβ1-42的tht的荧光强度分别由103.4±4.0下降到81.3±1.6,88.1±2.1和93.8±2.2。cs@se对aβ1-42聚集的抑制作用强于同剂量的cs和nano-se。这些结果表明，低浓度的cs@se即可以抑制aβ1-42的聚合。(图2)

实施例4cs@se对冈田酸引起的sh-sy5y细胞f-肌动蛋白损伤的影响

取对数生长期的sh-sy5y细胞以1×105个/3.5-cm皿的密度种植于激光共聚焦培养皿中，细胞培养箱中培养36h，吸弃培养基，加入含有不同浓度cs@se的无血清培养基(25μg/ml和50μg/ml)培养6h，加入冈田酸(oa)使其终浓度为20nm继续培养24h。冷pbs洗涤三次，0.3ml质量浓度4％多聚甲醛固定10min；冷pbs(50mm，ph7.2)洗涤三次，0.3ml10μg/ml的hoechst33342溶液孵育20min；冷pbs洗涤三次，0.3ml0.1μmol/ml罗丹明标记的鬼笔环肽溶液孵育40min；冷pbs洗涤三次，加抗荧光淬灭剂后，用激光共聚焦显微镜观察sh-sy5y细胞的亚细胞结构。如图3所示，无冈田酸的对照组细胞延展良好，树突较强，微丝致密，红色荧光强度较强。经冈田酸处理24h后，sh-sy5y细胞呈圆形，细胞树突收缩或消失，f-actin微丝疏松、无序，红色荧光强度较弱。50μg/ml的cs@se预孵育24h后，细胞树突恢复，微丝较长，密度较高，荧光强度较强。这些结果表明cs@se对肌动蛋白细胞骨架结构有明显的保护作用，这意味着cs@se可以减少冈田酸诱导的神经元细胞骨架的不稳定性。(图3)

实施例5cs@se对aβ1-42引起细胞内氧化应激损伤的影响

取对数生长期的sh-sy5y细胞以1×106个/10-cm皿的密度种植于培养皿中，细胞培养箱中培养48h，吸弃培养基，加入含有不同浓度cs@se的无血清培养基(25μg/ml和50μg/ml)继续培养，作用12h后，加入终浓度为10μmol/l经过预孵育的aβ1-42(37℃孵育72h)，再培养6h，按照相关ros、mda、gsh-px试剂盒的要求，采用不同的处理方法处理细胞后，按照说明书的要求测定细胞内ros、mda、gsh-px的水平。测定结果如图4所示，aβ1-42诱导组ros(图4中a，p

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。