巴马富硒农产品分布图（巴马富硒水有什么效果呢）

富硒大米硒蛋白提取方法研究

梁潘霞1，兰秀2，刘永贤1，2*，潘丽萍1，农梦玲2，邢颖1，廖青1，鹿士杨1，陈锦平1

(1．广西农业科学院农业资源与环境研究所，广西南宁530007;2．广西大学，广西南宁530005)

摘要:

【目的】优选富硒大米，研究提取分离硒蛋白的最佳生产工艺条件，为提高硒蛋白资源的开发利用提供参考。

【方法】采用碱提法提取硒蛋白，正交试验法优化大米硒蛋白的提取条件，采用考马斯亮蓝G-250试剂结合法测定蛋白含量，原子荧光法测定硒含量。以含硒蛋白质及硒得率为指标，研究影响富硒大米中含硒蛋白质提取的因素。

【结果】影响富硒大米含硒蛋白提取率的主次因素为:Na OH浓度＞料液比＞温度＞时间。富硒大米含硒蛋白提取的最佳工艺条件为提取温度50℃，碱液浓度0．14mol/L，提取时间5 h，料液比1∶30，此条件下硒蛋白提取率为57．11%。

【结论】采用正交试验法优化的碱提工艺可有效提高硒蛋白提取率，优化的工艺参数可在实际生产中推广应用。

关键词: 富硒大米; 硒蛋白; 正交试验; 提取率

Study on Extraction Method of Se-enriched Ｒice

LIANG Pan-xia1，LAN Xiu2，LIU Yong-xian1，2*，PAN Li-ping1，NONG Meng-ling2，XING Ying1，LIAO Qing1，LU Shi-yang1，CHEN Jin-ping1

( 1． Ｒesources and Environment Ｒesearch Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Guangxi Nanning 530007，China; 2． GuangxiUniversity，Guangxi Nanning 530007，China)

Abstract:

【Objective】The study aims to optimize the extraction process of selenoproteins from selenium-enriched rice in Guangxi and pro-vide reference for the exploitation and utilization of selenium protein resources．

【Method】Selenium-enriched rice was used as materials to ex-tract selenoproteins by alkali extraction method and to optimize the extraction process of selenoproteins by using the orthogonal experiment．Proteins and selenium content were measured by coomassie brilliant blue G-250 reagent and AFS ( atomic fluorescence spectrometry) respec-tively．

【Ｒesult】The most significant factor affecting extraction of rice selenoproteins was sodium hydroxide concentration ，followed by the ra-tio of solid-liquid，temperature and then extraction time． The optimum extraction conditions of rice selenoproteins: extraction temperature was50 ℃ ，sodium hydroxide concentration was 0． 14 mol / L，extraction time was 5h，and the ratio of solid-liquid was 1∶ 30．

【Conclusion】Thealkali extraction process optimized by orthogonal test can effectively improve the extraction rate of selenium protein，and the optimized processparameters can be popularized and applied in practical production．

Key words: Selenium-enriched rice; Selenoproteins; Orthogonal experiment; Extraction efficiency

【研究意义】微量元素硒是人体必需的营养元素。WHO调查数据显示，目前大约有10亿人面临着硒营养不良的问题，缺硒引起的“隐性饥饿”正威胁着人类健康［1］，科学合理的补硒已经成为我们增强身体素质的重要途径。大米是我国的主要粮食之一，其可作为富硒的中间载体，提取出的大米蛋白可作为新型的富硒营养产品，具有较高的营养价值。研究开发利用富硒大米中的硒蛋白，将是一种解决国内蛋白产业缺乏问题的新思路，对有效利用富硒大米的附加值有着现实意义。【前人研究进展】张涛［2］研究发现含硒蛋白是大米中硒的主要赋予形态，占总硒的73%，含硒蛋白中谷蛋白硒占总硒48%。方建军等［3］研究发现富硒大米中总硒含量高达206．71μg/kg，有机硒是硒主要赋予形态，占总硒81．70%。碱溶性硒蛋白是有机硒的主要存在形式，占53．40%，多糖硒9．28%，ＲNA硒占1．86%。李甜［4］利用单因素及响应面分析法对新疆新春36号黑小麦中硒蛋白做系统考察，发现硒蛋白含量为(240．52±0．3)mg/g，并摸索得到碱溶性硒蛋白提取条件为:NaOH溶液浓度0．17 mol/L，酸化pH4．7，(NH4)2SO4饱和度66．0%，料液比1∶10，在此条件下得到的硒蛋白提取率为76．7%。王珺等［5］在采用反复冻融辅助富硒茶中硒蛋白提取工艺研究中表明:在碱液浓度0．10 mol/L、提取时间3 h、提取次数2次、温度70℃、料液比1∶60相同条件下，反复冻融3次的实验组蛋白得率增长了20%。邹秀容［6］在通过超声波法提取米糠蛋白工艺研究中，确定最优条件为:超声时间50 min、超声功率380W、料液比1∶16，其蛋白得率达到51．66%。Gerge-ly［7］使用0．1 mol/L Na OH，30 m M三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)与酶法从香菇中提取硒蛋白。【本研究切入点】目前植物蛋白的提取方法研究较多的是碱法、酶法以及复合提取法等，但是由于不同研究者原辅料工艺的采用和试验环境等因素不尽相同，所得的研究结论也有所差异。此外，目前国内关于富硒大米中硒蛋白的提取工艺、提取条件的优化与确证方面鲜有报道。【拟解决的关键问题】探究碱法提取富硒大米中硒蛋白的效果，获得提取的最佳工艺条件，为提高硒蛋白资源的开发利用及为增加营养食品的附加值、多样性、方便化作出有力的支撑。

1材料与方法

1．1材料

富硒大米采自广西巴马白马村，该地区土壤硒平均含量为(0．43±1．24)mg/kg，采用大田自然栽培，常规管理。采收后的大米置于鼓风干燥箱中60℃下烘干，粉碎机粉碎至全部通过100目筛孔，密封置于干燥器中备用。

1．2主要仪器与试剂

AFS双道原子荧光光度计，TDZ5-WS高速冷冻离心机，TD-5-A离心机，ETHOS PLUS微波消解系统，紫外可见分光光度计，SHZ-88水浴恒温震荡器。NaOH、NaCl、HCl等主要试剂均为优级纯，实验用水均为超纯水。

1．3试验方案

1．3．1富硒大米硒蛋白提取液的筛选及提取工艺控制大米粉末与提取液料液质量体积比为1∶20，分别用0．1 mol/L氯化钠溶液、氢氧化钠溶液、盐酸溶液和水作为溶剂，常温下震荡提取3 h，25℃下4000 r/min离心20 min，取一定上清液在冰浴下缓慢加入4倍溶液体积冰丙酮于－24℃冰箱放置12h沉淀蛋白，4℃下10 000 r/min离心15 min，倒掉上清液并在通风橱让丙酮挥发，得粗蛋白，测硒含量，选择最佳溶剂。

1．3．2单因素试验在得到最佳溶剂基础上，利用该提取剂进行单因素实验，分析不同料液质量体积比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60)、NaOH浓度(0．02、0．05、0．08、0．10、0．14、0．20 mol/L)、温度(20、30、40、50和60℃)、提取时间(1、2、3、4、5和6h)对硒蛋白提取的影响规律。

1．3．3正交试验参考单因素试验结果，对料液比、NaOH溶液浓度、提取温度和提取时间四个因素进行L9(34)正交试验设计，通过L9(34)正交试验确定最佳的提取条件。每个因素水平组合试验重复3次。正交因素水平表见表1。

1．4测定项目及方法

1．4．1硒含量测定采用氢化物原子荧光光谱法，按照GB/T 5009．93-2010［23］中的方法测定硒含量。

1．4．2蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝G-250试剂比色法。AA800紫外分光光度计595 nm处测定吸光度值，用牛血清蛋白制作标准曲线，求曲线回归方程，从而算出总蛋白质含量。

1．4．3硒得率的计算

硒得率(%)=A×B/C×100

其中，A 为从大米中所提取出的蛋白质的质量分数，B为蛋白质中硒的质量分数 ，C 为大米中硒的质量分数。

表 1 正交因素水平

Table 1 Orthogonal factor level

1．5统计分析

采用Excel 2003和SPSS 17．0系统分析软件对测定的各个指标数据进行处理。

2结果与分析

2．1提取液的选择

由图1可知，以硒得率为指标，Na OH提取硒蛋白效果最好，硒得率为52．21%，是水提取的7倍，四种提取剂提取硒蛋白效率从高到低为NaOH＞NaCl＞HCl＞H2O，因此采取NaOH作为提取剂。

2．2单因素试验

在保持其他条件不变(提取液浓度为0．1 mol/L、提取温度为常温，提取时间3 h)，改变液料比，由图2可知，随着液料比的增大，大米蛋白质提取率先升高后下降，液料比増加到1∶40时，提取率达到最高值15．56%，硒含量1．08μg/g，而液料比从1∶50到1∶60，提取率急速下降。因此，1∶40 g/m L是单因素实验优化的最佳料液比。

2．3提取时间对大米硒蛋白提取效果的影响在保持其他条件不变(提取液浓度为0．1 mol/L、提取温度为常温，液料比为1∶20)，改变提取时间，大米硒蛋白提取率随提取时间的变化如图3所示。一定条件下，提取时间－提取率曲线呈现先升高后降低的趋势，在4 h时蛋白提取率达到峰值15．45%;此时硒含量也达到最大1．11μg/g，提取时间超过4 h后蛋白的提取率反而呈现下降趋势，这可能是因为蛋白质分子溶胀导致溶出率降低。因此，4 h是单因素实验优化的最佳提取时间。

2．4提取温度对大米蛋白提取效果的影响

在保持其他条件不变(提取液浓度为0．1 mol/L、提取时间3 h，液料比为1∶20)，改变提取温度，由图4可知，当提取温度在20℃升高到40℃时，大米蛋白提取率随着温度的升高而增加，40℃时达到最大，增幅为20℃的10．07%;随着提取温度的进一步上升，提取率反而呈下降趋势。因此，确定单因素实验优化硒蛋白的提取最佳温度为40℃。

2．5碱液浓度对大米蛋白提取率效果的影响

在保持其他条件不变(提取时间3 h、提取温度为常温，液料比为1∶20)，改变提取液浓度，由图5可知，大米硒蛋白提取率随提取液浓度的升高而缓慢提高后快速下降，在浓度为0．02～0．08 mol/L范围内，提取率变化不大，在0．08～0．14 mol/L范围时，提取率变化显著，在0．14 mol/L是提取率达到最高值28．07%，碱液浓度为0．2 mol/L时，提取率最低。因此，碱液浓度0．14 mol/L是单因素实验优化的最佳提取液浓度。

2．6正交试验结果

由表2中的极差Ｒ值可以看出，氢氧化钠浓度是影响提取率的最主要因素，其次为料液比，浸提温度和浸提时间对提取率影响较小。组合A1B3C3D3提取率最高，即料液比1∶30 g/m L、氢氧化钠浓度0．14 mol/L、提取温度50℃、提取时间5 h，此条件下提取率为57．11%。

3讨论

本研究中的最佳的提取剂为Na OH溶液，这与前人的研究结果一致［8］。这可能与大米中的氢键、酰胺键和二硫键在高浓度碱条件下水解，进而释放更多的蛋白质有关［9－11］。Fang等［12］研究表明，通过提取大米中4类蛋白，分析蛋白中硒的含量，发现硒主要存在于碱溶谷蛋白中。胡秋辉等［13］研究表明，清蛋白和醇溶蛋白并不是硒的主要存在蛋白，Se主要存在于分子量较大的碱溶谷蛋白和球蛋白中，且碱溶含硒蛋白为主要组分。张帅等［14］的研究也表明，碱提法工艺成本低，提取率高、提取方法简单。在获得最佳提取剂的基础上，以提取剂浓度、料液比、提取时间和提取温度进行单因素试验，硒蛋白提取率开始随着碱液浓度的增大而明显增大，但在0．14 mol/L后开始下降。这与彭炜［8］的研究结果有相似之处。这可能是因为溶液pH值可以直接改变两性分子蛋白质的表面所带电荷，进而对蛋白质与蛋白质、蛋白质与溶剂间的相互作用造成影响，从而改变蛋白质的溶解性。有研究表明，蛋白质溶解度在p H大于7时显著升高，在p H大于12时，90%以上的蛋白质可溶出［15］。碱法提取条件不同时蛋白提取率结果就会不同，有研究表明，提取蛋白时，提取液浓度不宜过高，否则会导致蛋白质中赖氨酸与丙氨酸或胱氨酸发生缩合反应［16］，蛋白质难以溶出，降低蛋白质的纯度和品质，从而影响蛋白质的营养价值与商用价值，导致提取率的下降［17］。

本研究发现提取率随着料液比增大而增大，但在一定比例后开始下降。这与曹斌［18］在用碱法提取恩施碎米荠时的试验结果一致。这可能是因为提取溶剂在料液比较低时粘度大，蛋白浓度较高，蛋白质分子间的斥力大，蛋白质的扩散作用小，因此提取速率较低。随着料液比的增加，提取溶剂粘度下降、分子间的斥力减小，蛋白质的扩散作用变大，并不断溶出，提取率则不断上升。然而当料液比继续增大时，提取率不升反降，原因可能是高的料液比增大了提取难度，造成了提取率的下降。

本研究提取温度单因素试验结果表明，在提取温度大于40℃以后，提取率开始下降。有研究表明，随着的温度的增高，蛋白质的三维立体结构发生伸展，增大了其与水分子的相互作用，且分子的扩散作用随着温度的增高而增高，加快了蛋白质的溶解速率，但增加到一定温度时，蛋白质空间结构被破坏，其疏水集团暴露，导致蛋白质的溶解度下降，提取率降低［19－21］。吕佼［24］在对板栗蛋白提取工艺优化研究中发现，板栗蛋白提取率随着温度的升高而降低，这可能是由于板栗淀粉发生糊化作用，与蛋白质结合，使蛋白质溶解率下降，从而降低蛋白质的提取率。在提取时间1～4 h范围内，硒蛋白提取率随着提取时间的增加而增加，这可能是因为与硒结合能力强的蛋白质不断溶解有关［22］。当提取时间超过4 h时，蛋白的提取率反而呈现下降趋势，这可能是因为蛋白质分子溶胀导致溶出率降低。

参考单因素试验结果，对料液比、NaOH溶液浓度、提取温度和提取时间四个因素进行L9(34)正交试验，发现9个组合的蛋白提取率均比单因素试验高，那是因为多因素实验中，每个因素都不是单独发挥作用，因素间存在相互作用，具有强烈的搭配效果。通过比较极差Ｒ值大小，得到各因素对提取率的影响大小为NaOH浓度＞料液比＞提取温度＞提取时间。最后方差分析得到的最佳提取条件A1B3C3D3。虽然碱提取法具有成本低廉、易于操作和控制的优点，但是需要较长的提取的时间，提取效果也未达到最佳。因此，还可通过复合法提取法，例如加入超声波辅助提取、碱法与酶法结合，或采用微射流辅助法来提高硒蛋白提取率。广西硒资源十分丰富，随着对大米硒蛋白更深入的研究，包括提取硒蛋白的工艺、硒蛋白基础理论特性及功能和利用价值等方面，大米硒蛋白将有望广泛地应用于营养保健、医疗和食品行业上，这不仅能节约资源，而且能为丰富大米资源的开发利用开辟新的思路，使大米得到深层次的开发与应用，将资源优势转化为经济优势具有重要的理论和现实意义。

4结论

影响富硒大米含硒蛋白提取率的主次因素为:NaOH浓度＞料液比＞温度＞时间，富硒大米含硒蛋白提取的最佳工艺条件为提取温度50℃，碱液浓度0．14 mol/L，提取时间5 h，料液比1∶30。采用正交试验法优化的碱提工艺可有效提高硒蛋白提取率，优化的工艺参数可在实际生产中推广应用。

参考文献:

［1］徐庆国，刘红梅，黄 丰． 我国富硒农产品开发与推广的探讨［J］． 作物研究，2013，27( 5) : 461 －464．

［2］张 涛． 富硒大米及富硒酵母中的硒形态分析［D］． 内蒙古科技大学包头医学院硕士学位论文，2007: 28 －34．

［3］方建军，祝华明，方 芳，等． 富硒大米中硒形态分析［J］． 食品研究与开发，2012，33( 9) : 146 －150．

［4］李 甜． 新春 36 号黑小麦中硒的分布、富硒蛋白的制备及抗氧化活性研究［D］． 石河子大学硕士学位论文，2016: 11 －14．

［5］王 珺，董文宾，杨芙莲，等． 富硒茶中硒蛋白冻融法辅助提取工艺优化［J］． 食品与机械，2015，31( 2) : 211 －215．

［6］邹秀容，朱建华，曹思铭． 超声波法提取米糠蛋白的研究［J］． 食品工业科技，2013( 16) : 280 －282．

［7］Gergely V，Kubachka K M，Mounicou S，et al． Selenium speciationin Agaricus bisporus and Lentinula edodes mushroom proteins usingmulti-dimensional chromatography coupled to inductively coupledplasma mass spectrometry［J］． J Chromatogr A，2006，1101 ( 1 －2) : 94 － 102．

［8］彭 炜． 富硒平菇中硒蛋白的提取及特膳食品的开发［D］． 贵州大学，2016: 16 －19

［9］朱珈庆，李帅斐，于 雷． 米糠蛋白碱法提取联合微波与酶法改性工艺的优化［J］． 粮食与油脂，2017 ，30( 7) : 60 －64

［10］HAN S W，CHEE K M，CHO S J． Nutritional quality of rice branprotein in comparison to animal and vegetable protein［J］． FoodChemistry，2015，172: 766 － 769．

［11］郑煜焱，曾 洁，李 晶，等． 米糠蛋白的组成及功能性［J］． 食品科学，2012，33( 23) : 143 －149．

［12］Fang Y，Brittany C，Zhang Y F，et al． Distribution and in vitro a-vailability of selenium in selenium-containing storage protein from se-lenium-enriched rice utilizing optimized extraction［J］． J Agric FoodChem ，2010，58( 17) : 9731 － 9738．

［13］胡秋辉，陈 曦，方 勇，等． 富硒米糠蛋白的优化制备及其蛋白营养复配研究［J］． 中国农业科学，2014，47( 2) : 374 －382．

［14］张 帅，张培宜，冯翠萍． 板栗蛋白质的提取及多肽的制备［J］． 山西农业大学学报( 自然科学版) ，2011，52( 1) : 73 －76．

［15］江爱芝，王 燕． 米糠蛋白提取方法研究进展［J］． 粮食与油脂，2009( 10) : 11 －12．

［16］邓桂春，侯松嵋，田冬梅，等． 富硒蛹虫草中硒多糖的分离与分析［J］． 光谱学与光谱分析，2006，26( 3) : 522 －525．

［17］Fang Y，Zhang Y F，Brittany C，et al． Identification of seleniumcompounds using HPLC-ICPMS and nano-ESI-MS in selenium-en-riched rice via foliar application［J］． J． Anal． At． Spectrom． ，2009，24( 12) : 1657 － 1664．

［18］曹 斌． 恩施碎米荠含硒蛋白分离提取、初步纯化、体外抗氧化活性研究［D］． 贵州大学，2016: 35 －50．

［19］汪 龙，杨 涛，蒋 婷，等． 不同提取方法对大米蛋白功能特性的影响研究［J］． 食品工业，2014，35( 10) : 60 －63．

［20］王 芳，刘 华，董梅红． 桑叶蛋白的功能特性研究． 食品科学，2010，31( 11) : 81 －86．

［21］江志炜，沈蓓英． 蛋白质加工技术［M］． 上海: 化学工业出版社，2003: 192 －193．

［22］李喜红，代红丽，魏安池． 酶法从脱脂米糠中提取蛋白质［J］．粮油加工与食品机械，2005( 6) : 62 －64．

［23］中华人民共和国卫生部． GB/T 5009． 93-2010． 食品中硒的测定［S］． 北京: 中国标准出版社，2010．

［24］吕 佼． 板栗蛋白的提取工艺优化、功能特性及其应用研究［D］． 北京林业大学，2015: 15 －18．