五子衍宗丸与锌硒宝（五子衍宗丸和锌硒片哪个好）

基于网络药理学的五子衍宗丸抗睾丸炎症作用机制

胡珂，许亚辉，刘殿龙，崔力丹，郭健通讯作者

（北京中医药大学中医学院，北京 102488）

睾丸炎症是睾丸在感染或非感染因素的刺激下而产生的免疫性防御反应，其发生的分子机制始于对病原相关分子模式（PAMPs）和损伤相关分子模式（DAMPs）的识别。睾丸发生炎症会影响类固醇生成和精子发生，使生殖细胞凋亡异常和组织损伤加重，最终导致男性不育。目前临床上治疗睾丸炎症的药物主要是针对急性炎症的抗生素类药物，如盐酸左氧氟沙星、阿奇霉素、青霉素等。引起睾丸炎症的病因很复杂，涉及细菌或病毒感染、药物、损伤、高温、氧化应激和异常免疫反应。然而，大多数治疗药物只强调广谱抗菌，而没有考虑睾丸炎症发生的复杂过程。

五子衍宗丸是《摄生众妙方》中经典补肾方剂，全方由枸杞子、菟丝子、覆盆子、北五味子、车前子组成，具有补中寓泻、补而不腻的组方特点。近年来有关五子衍宗丸抑制炎症反应的报道逐渐增多，如研究证实，五子衍宗丸可调节帕金森病小鼠脑内的炎症进而减少神经元损伤、还能通过降低炎性因子表达改善实验性自身免疫性脑脊髓炎的临床评分、以及抑制双环己酮草酰二腙（CPZ）诱导的脱髓鞘模型的炎症反应从而促进再髓鞘化，这些都提示五子衍宗丸在抗炎作用方面有潜力。由于目前尚未见五子衍宗丸抑制睾丸炎症的实验报道，因此本研究通过网络药理学的分析方法，对五子衍宗丸抗睾丸炎症的有效成分、作用靶点及信号通路进行了归纳分析。此外，本研究还进行了验证试验，验证了与五子衍宗丸抗睾丸炎症相关的关键靶点和途径。

材料和方法

1.1五子衍宗丸成分筛选和靶点预测

通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，）根据口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18这2个重要的化合物药代动力学参数条件进行初步筛选以获得复方有效成分。在Pubchem数据库（）中搜索并下载有效成分2D结构的SDF格式文件，将SDF格式文件导入至SwissTargetPredicition平台，设置物种为“Homo sapiens”，检索每个化合物可能性大于0的靶标。未预测到靶标的化合物，通过TCMSP数据库搜索靶点，然后将所有靶标名称都放入UniProt蛋白质数据库（）中，以搜索由人类物种选择的靶标基因名称。借助Cytoscape3.7.1软件可视化“五子衍宗丸药物组成-有效成分-靶点”网络。

1.2睾丸炎症相关靶点收集

以“Testicular inflammation”为关键词，从GeneCards数据库（）和人类在线孟德尔遗传数据库（OMIM，）收集与睾丸炎症相关的基因，并删除搜索结果中重复的基因。其中，在GeneCards数据库检索结果中，仅保留RelevanceScore值大于中位数的靶基因。利用R语言将五子衍宗丸有效成分靶点和睾丸炎症靶点取交集并绘制韦恩图。

1.3“五子衍宗丸有效成分-疾病靶点”网络图的构建

将五子衍宗丸5味中药的有效成分和其作用的疾病靶点整理成Excel文件，导入Cytoscape3.7.1软件可视化“五子衍宗丸有效成分-疾病靶点”网络并进行网络拓扑分析，根据Degree值判断发挥药效的主要成分。

1.4蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建

将交集靶点提交至STRING11.0数据库（），生物种类设定为“Homo sapiens”，最小互相作用阈值设定为“highest confidence”（>0.4）并剔除游离的靶点，其余设置均为默认设置，再导出数据通过 Cytoscape3.7.1 构建蛋白互作（PPI）网络模型并进行网络拓扑分析。

1.5 基因本体（GO）分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析

将五子衍宗丸抗睾丸炎症的潜在靶点录入 Metascape 平台，默认设置 P

验证试验

2.1 材料

SPF级雄性SD大鼠购自北京斯贝福实验动物有限公司，许可证号SCXK（京）2019-0010；全蛋白提取试剂盒、BCA蛋白含量检测试剂盒凯基生物公（凯基生物公司，货号KGP250、KGP902）；SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（普利莱公司，批号B1012），甲醇（北京化工厂，批号B0301006），PVDF膜（美国Millipore公司，批号ROBB27121）；5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液、4×SDS-PAGE分离胶缓冲液、30%Acr/Bis（29:1）、4×SDS-PAGE浓缩胶缓冲液（百诺威公司，货号S1006，S1002，S1001，S1003）；TEMED、Non-fatPowderedMilkBioRuler（美国BioRuler公司，货号分别为r0909、R26335-100G）；NLRP3、ASC一抗（美国Abcam公司，1:1000，批号分别为ab263899、ab180799，）；胱天蛋白酶（Caspase）-1一抗、β-肌动蛋白（β-actin）一抗、兔二抗（美国Proteintech公司，批号22915-1-AP，1:800；20536-1-AP，1:2500；SA00001-2，1:5000）。

2.2分组及给药

35只6周龄SD大鼠分为正常组、模型组及五子衍宗丸低、中、高剂量5组。适应性饲养一周后开始灌胃，灌胃周期15d。依据五子衍宗丸临床有效剂量折算，低、中、高剂量组的给药剂量分别是0.5、1、2g·kg-1·d-1，正常组和模型组给与生理盐水，在灌胃的第11天，除正常组外，其余4组进行43℃水浴热应激30min，连续5d，于第16d取材（已获北京中医药大学医学与实验动物伦理委员会批准，批号BUCM-4-2019030701-1053）。

2.3蛋白免疫印迹法（Westernblot）检测

NLRP3/ASC/Caspase-1信号通路相关蛋白表达情况睾丸组织提取全蛋白，BCA蛋白定量法测蛋白浓度之后将蛋白变性并分装保存于-20℃，凝胶电泳转膜至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1h后，孵育NLRP3、ASC、Caspase-1一抗，1×TBST稀释，4℃过夜；二抗用1×TBST按1：5000比例稀释，加入二抗前用1×TBST洗3次，每次10min，而后室温下二抗摇床孵育1h，再用1×TBST洗3次，每次10min，ECL化学发光液显影1~3min，采用ChemiScope6100型化学发光成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司）进行分析，以β-actin为内参，计算各组睾丸组织NLRP3/ASC/Caspase-1信号通路相关蛋白表达情况，实验重复 3 次。Western blot 条带图使用 Image J 软件检测灰度值，数据进行统计分析后利用 GraphPad Prism 6 软件绘制柱状图。

2.4统计学处理

数据用SPSS20.0软件进行统计分析，计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，以P

结果

3.1 五子衍宗丸有效成分和靶点的筛选

通过 TCMSP 数据库从五子衍宗丸 5 味中药中共筛选出 72 种有效成分，见图 1。其中，beta-谷甾醇 （MOL000358）、山柰酚（MOL000422）、CLR（MOL000953）、槲皮素（MOL000098）和 Sitosterol（MOL000359） 同时存在于多种中草药中。结合 SwissTargetPredicition 平台和 TCMSP 数据库得到五子衍宗丸有效成分靶点 624 个。五味子酯乙、五味子醇甲、atropine、去氧哈林通碱、阿托品、五味子素 C、槲皮素、山柰酚、异鼠 李素、高车前素、海波拉亭等在五子衍宗丸药物组成-有效成分-靶点网络中 Degree 值排名较高，说明这些化 合物可能是五子衍宗丸发挥药效的主要有效成分。见表 1。

结果

3.1五子衍宗丸有效成分和靶点的筛选

通过TCMSP数据库从五子衍宗丸5味中药中共筛选出72种有效成分，见图1。其中，beta-谷甾醇（MOL000358）、山柰酚（MOL000422）、CLR（MOL000953）、槲皮素（MOL000098）和Sitosterol（MOL000359）同时存在于多种中草药中。结合SwissTargetPredicition平台和TCMSP数据库得到五子衍宗丸有效成分靶点624个。五味子酯乙、五味子醇甲、atropine、去氧哈林通碱、阿托品、五味子素C、槲皮素、山柰酚、异鼠李素、高车前素、海波拉亭等在五子衍宗丸药物组成-有效成分-靶点网络中Degree值排名较高，说明这些化合物可能是五子衍宗丸发挥药效的主要有效成分。见表1。

3.2睾丸炎症相关靶点的获取

从GeneCards数据库获得睾丸炎症靶点2689个，将RelevanceScore值>中位数2.46（Score最大值为72.96，最小值为0.14）的目标靶点作为睾丸炎症的潜在靶点，筛选后得到1346个靶点，然后合并从OMIM数据库检索得到的靶点后删除重复值，最终得到1476个睾丸炎症相关靶点。韦恩图分析得到五子衍宗丸与睾丸炎症交集靶点196个见图2。

3.3“五子衍宗丸有效成分-疾病靶点”网络构建及拓扑分析

Degree（连接度）值被广泛应用于评价节点在网络中的重要性，拓扑分析结果显示，五味子素C（MOL008992）、高车前素（MOL001735）、异鼠李素（MOL000354）、槲皮素（MOL000098）、海波拉亭（MOL007819）、五味子酯乙（MOL008957）和山柰酚（MOL000422）等在该网络中的Degree值排名较高，说明这些化合物在五子衍宗丸抗睾丸炎症过程中起重要作用。见图3。

3.4PPI网络构建及网络拓扑分析

PPI网络中，节点代表靶基因，连线代表靶基因之间相互作用，靶点在PPI网络中的Degree值越大，节点越大，颜色由红到蓝渐变，表示Degree值由大到小，见图4。以拓扑特征值Degree高于中位数为筛选条件，从196个交集靶点中筛选出96个关键靶点，包括IL6、Akt1、MAPK3、TNF和MAPK1等与炎症相关的靶点，这些靶点与其它靶点联系紧密且参与多条信号通路，说明五子衍宗丸抗睾丸炎症过程是多靶点多途径间相互作用的，见表2。

3.5GO分析

Metascape平台分析显示，五子衍宗丸抗睾丸炎症的潜在靶点涉及对细菌起源分子的反应、对外界刺激反应的正向调节及对细胞外刺激的反应等生物学过程；MF富集分结果表明，靶标大多与蛋白激酶活性、核受体活性和蛋白质均聚活性有关；CC富集分析结果表明，靶标大多富集在受体复合物、膜筏及细胞质核周区域部分。见图5。

Fig.5 GO enrichment analysis of WuziYanzongwan for anti-testicular inflammation

3.6 KEGG 通路富集分析

借助Metascape平台进行KEGG通路富集分析，结果表明，五子衍宗丸抗睾丸炎症主要集中于癌症通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性、癌症中的转录调控异常、钙信号通路、Apelin信号通路和NOD样受体信号通路等，见图6。其中，NOD样受体信号通路上的富集靶点参与NLRP3炎症小体信号通路和NOD/NF-κB信号通路等亚信号通路，通过影响促炎性细胞因子或趋化因子等物质的合成发挥促进炎症效应的作用。而五子衍宗丸可能通过调控这些靶点的表达，阻断相应信号通路的传导，进而阻断睾丸炎症的发生发展。见图7。

3.7实验验证

为了进一步研究五子衍宗丸对睾丸炎症的影响，建立了热应激大鼠模型。Westernblot结果显示，经热应激处理的大鼠睾丸NLRP3炎症小体通路上关键蛋白NLRP3、ASC和Caspase-1p20的表达明显升高，而Pro-caspase-1的表达明显降低。服用五子衍宗丸后，NLRP3、ASC和Caspase-1p20的表达明显降低，而Pro-caspase-1的表达明显升高，见图8和表3。

讨论

中医认为，炎症是机体内正邪相争的矛盾运动过程。因此，睾丸炎症的总体治则是扶正祛邪。五子衍宗丸复方中枸杞子和菟丝子共为君药补肾阳、填精补髓，覆盆子和北五味子共为臣药补肾固涩，车前子为佐药利小便，五子衍宗丸全方诸药相配，共奏补肾益精之功，则肾精肾气充足，故能抵御各种损伤因子的刺激。

现代研究报道，五子衍宗丸可通过升高血清免疫球蛋白G、IL-2的含量，降低IL-6表达水平，显著改善肾精亏虚型大鼠的免疫功能；此外，有研究证明五子衍宗丸还可调节无精症小鼠FcepsilonRI通路上TNF-α、IL-3等基因的表达，提高机体免疫力。因此，本研究拟进一步通过网络药理学分析的方法探索五子衍宗丸抗睾丸炎症的靶点和作用机制，为该方应用于睾丸炎症的治疗提供更多证据支持。

首先，结合五子衍宗丸的有效成分、潜在作用靶点和睾丸炎症靶点，预测五子衍宗丸抗睾丸炎症的潜在靶点，然后构建“五子衍宗丸有效成分-疾病靶点”网络，结合拓扑参数分析，提取出五子衍宗丸抗睾丸炎症的核心成分，包括五味子素C、高车前素、异鼠李素、槲皮素、海波拉亭、五味子酯乙和山柰酚。通过文献调研发现，许多研究报道了这些化合物在体内外的抗炎作用。例如，五味子素C能通过抑制THP-1细胞中NLRP3炎症小体的激活进而有效抑制IL-1β分泌和细胞凋亡，还有研究报道五味子素C能够抑制成熟树突状细胞分泌细胞因子IL-6、IL-10和IL-12。此外，高车前素能抑制Raw264.7和HT29细胞中LPS诱导的炎症介质生成，如肿瘤坏死因子TNF-α和IL-1β。异鼠李素可显著降低TNF-α诱导的BEAS-2B细胞中IL-1β、IL-6、IL-8和趋化因子（C-X-C基序）配体10的表达。槲皮素可抑制脂多糖（LPS）诱导的小鼠RAW264.7细胞的炎症反应，显著降低TNF-α、IL-6和IL-1β的表达。还有研究学者用IL-1β刺激的大鼠关节软骨细胞证明了山柰酚具有显著的抗炎作用，山柰酚还可减轻LPS诱导的上皮-内皮共培养模型中Caco-2细胞单层的IL-8分泌过表达。上述结果提示五子衍宗丸中的多种有效成分具有明显的抗炎潜力。

进一步采用富集分析的方法，发现了多种与睾丸炎症密切相关的典型生物学过程，例如对细菌起源分子的反应、对外界刺激反应的正向调节及对细胞外刺激的反应。KEGG通路富集结果显示，五子衍宗丸抗睾丸炎症主要集中于癌症通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性、癌症中的转录调控异常、钙信号通路、Apelin信号通路和NOD样受体信号通路。通过文献调研发现，钙信号通路主要与激活受精、增殖、新陈代谢和分泌等过程有密切关系，Apelin信号通路主要与体内平衡、心血管维持、血管生成、神经保护作用及衰老相关的肌肉无力等生理作用相关。而NOD样受体（NLRs）蛋白质家族是一类位于胞浆的模式识别受体（PRR），它通过识别PAMPs（包括脂多糖LPS、细菌鞭毛等）和DAMPs（包括活性氧ROS、K+外流和Ca+内流等）参与促炎症效应和调控促炎性因子的合成。有的NLRs（如NLRP6、NOD1/NOD2和NLRP12）通过MAPK和NF-κB途径来调控生长和对刺激的免疫反应，而更多的NLRs（如NLRP3）则形成多蛋白复合物（称为炎症小体），通过凋亡相关斑点样蛋白（ASC）招募和激活半胱氨酸酶1前体（Pro-caspase-1），激活的半胱氨酸酶1（Caspase-1）切割IL-1β和IL-18的前体，产生相应的成熟细胞因子IL-1β和IL-18，参与炎症反应。此外，有研究证明抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β途径（即NLRP3炎症小体通路）能改善睾丸炎症和细胞凋亡。从GO细胞组分的富集分析结果可以看出，五子衍宗丸治疗睾丸炎症的潜在靶点在“受体复合物”中显著富集。另外，从NOD样受体信号通路上的富集靶点参与的亚通路可以看出，ASC、CASP1、IL-1β和IL-18是NLRP3炎症小体信号通路、NLRC4炎症小体信号通路和Pyrin炎症小体信号通路上共有的关键蛋白，而NLRP3、CASP1是五子衍宗丸抗睾丸炎症的关键靶点。因此，笔者推测NLRP3炎症小体通路可能是五子衍宗丸治疗睾丸炎症的重要信号通路之一。

在网络药理学分析结果的基础上，构建热应激大鼠模型，采用Westernblot方法检测热应激大鼠睾丸组织NLRP3/ASC/Caspase-1信号通路的变化及五子衍宗丸的治疗作用，探讨五子衍宗丸对热应激大鼠睾丸组织NLRP3/ASC/Caspase-1信号通路的影响。结果表明，经热应激处理的大鼠睾丸NLRP3和ASC蛋白表达明显升高，且未活化的Caspase-1明显减少而活化片段Caspase-1p20则明显增多，证明热应激能激活NLRP3炎症小体通路和诱发睾丸炎症，而五子衍宗丸能抑制NLRP3、ASC蛋白的表达和Caspase-1蛋白的活化，说明五子衍宗丸可能通过抑制NLRP3炎症小体通路的激活从而抑制睾丸炎症。

综上所述，本研究通过网络药理学和生物学实验验证，表明五子衍宗丸可通过多靶点、多途径发挥抗睾丸炎症的作用，最显著的机制可能与抑制NLRP3炎症小体通路激活有关。