富硒农产品含量检测（富硒农产品硒含量分类要求）

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 CN 113295762 A(43)申请公布日 2021.08.24(21)申请号 2.9G01N 1/34 (2006.01)G01N 1/42 (2006.01)(22)申请日 2021.05.26(71)申请人 陕西科技大学地址 710021 陕西省西安市未央区大学园申请人 安康市富硒产品研发中心(72)发明人 贾玮周媛媛夏曾润石琳祁蒙(74)专利代理机构 西安通大专利代理有限责任公司 61200代理人 马贵香(51)Int.Cl.G01N 27/626 (2021.01)G01N 1/28 (2006.01)G01N 1/44 (2006.01)G01N 1/38 (2006.01)权利要求书2页 说明书6页 附图1页(54)发明名称一种天然富硒农产品中蛋白硒的检测方法(57)摘要本发明一种天然富硒农产品中蛋白硒的检 测方法，用超纯水对农产品粉碎后的粉末超声提 取，离心后分离沉淀，得到沉淀和提取液，将沉淀 同样处理得到的提取液合并后得到提取液A；将 超纯水换为NaCl溶液、乙醇溶液和NaOH溶液，得 到提取液B、C和D；调节各个提取液的pH至水、盐、 醇和碱溶性硒蛋白的等电点，离心分离得到对应 的硒蛋白；在这些硒蛋白中分别加入酸解体系进 行湿法消解，后依次赶酸、冷却和定容，得到对应 的蛋白硒检测液；将四种检测液用电感耦合等离 子体发射光谱法进行检测，将每个发射光谱强度 带入硒标准溶液得到的线性回归方程中，得到天 A 然富硒农产品中水溶性蛋白硒、盐溶性蛋白硒、2 醇溶性蛋白硒和碱溶性蛋白硒的浓度。

6 7 5 9 2 3 1 1N C CN 113295762 A权利要求书1/2页1.一种天然富硒农产品中蛋白硒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，将待提取的天然富硒农产品粉碎后，得到粉末，将粉末分为不少于四份后将其 中一份按步骤1a处理，得到提取液A；步骤1a，使用超纯水对粉末进行超声提取，得到混合体系a，再将混合体系a离心后分离 沉淀，得到沉淀物a和提取液a，将沉淀物a用处理粉末的方式进行处理，得到提取液b，将提 取液b与提取液a合并后得到提取液A；将步骤1a中的超纯水分别替换为NaCl溶液、乙醇溶液和NaOH溶液，然后分别重复步骤 1a，对应得到提取液B、提取液C和提取液D；步骤2，调节提取液A的pH至水溶性硒蛋白的等电点，之后离心分离得到水溶性硒蛋白； 调节提取液B的pH至盐溶性硒蛋白的等电点，之后离心分离得到盐溶性硒蛋白；调节提取液 C的pH至醇溶性硒蛋白的等电点，之后离心分离得到醇溶性硒蛋白；调节提取液D的pH至碱 溶性硒蛋白的等电点，之后离心分离得到碱溶性硒蛋白；步骤3，在水溶性硒蛋白、盐溶性硒蛋白、醇溶性硒蛋白和碱溶性硒蛋白中分别加入酸 解体系进行湿法消解，之后依次赶酸、冷却和定容，分别得到水溶性蛋白硒检测液、盐溶性 蛋白硒检测液、醇溶性蛋白硒检测液、碱溶性蛋白硒检测液；步骤4，先将步骤3所述的四种检测液分别采用电感耦合等离子体发射光谱法进行检 测，得到不同的发射光谱强度，将每个发射光谱强度带入硒标准溶液在电感耦合等离子体 发射光谱法下得到的线性回归方程中，得到天然富硒农产品中水溶性蛋白硒、盐溶性蛋白 硒、醇溶性蛋白硒和碱溶性蛋白硒的浓度。

2.根据权利要求1所述的天然富硒农产品中蛋白硒的检测方法，其特征在于，步骤1将 所述的天然富硒农产品粉碎后过100目筛，得到粉末。3.根据权利要求1所述的天然富硒农产品中蛋白硒的检测方法，其特征在于，步骤1中 所述的超纯水与粉末的比例为5mL：0.5g；NaCl溶液中NaCl与粉末的比例为0.25mmol：0.5g； 乙醇溶液中乙醇与粉末的比例为3.75mL：0.5g；NaOH溶液中NaOH与粉末的比例为0.5mmol： 0.5g。4.根据权利要求1所述的天然富硒农产品中蛋白硒的检测方法，其特征在于，步骤1a中 所述的超声提取在30～40℃下进行40～60min。5.根据权利要求1所述的天然富硒农产品中蛋白硒的检测方法，其特征在于，步骤1a中 所述的混合体系a在0～4℃下离心。6.根据权利要求1所述的天然富硒农产品中蛋白硒的检测方法，其特征在于，步骤2使 用0.1mol/L的盐酸调节提取液A、提取液B、提取液C和提取液D的pH。7.根据权利要求1所述的天然富硒农产品中蛋白硒的检测方法，其特征在于，步骤2中 所述的离心均在0～4℃下进行。8.根据权利要求1所述的天然富硒农产品中蛋白硒的检测方法，其特征在于，步骤3在 水溶性硒蛋白、盐溶性硒蛋白、醇溶性硒蛋白和碱溶性硒蛋白中分别均加入超纯水、硝酸和 过氧化氢进行加热，超纯水、硝酸、过氧化氢和步骤1a中粉末的比例为(10～20)mL：(3～5) mL：(1～3)mL：0.5g，再进行赶酸。

9.根据权利要求8所述的天然富硒农产品中蛋白硒的检测方法，其特征在于，赶酸后所 得消化液的体积与超纯水的体积之比为(1～2)：(10～20)。22 CN 113295762 A权利要求书2/2页10.根据权利要求1所述的天然富硒农产品中蛋白硒的检测方法，其特征在于，步骤4采 用电感耦合等离子体发射光谱法进行检测时，工作参数如下：高频功率为1100～1200w，泵速为40～60rpm，光室温度为30～40℃，重复4～8次。33 CN 113295762 A说明书1/6页一种天然富硒农产品中蛋白硒的检测方法 技术领域 [0001] 本发明涉及蛋白硒提取及检测技术领域，具体为一种天然富硒农产品中蛋白硒的 检测方法。 背景技术 [0002] 硒具有清除人体内自由基、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、预防心肌梗塞和心脑血管疾 病、预防癌变、提高机体免疫力等生物学功能，已被世界卫生组织和中华医学会定为继碘、 锌之后的第三大微量营养保健元素。人体中的硒必须从体外摄取以满足自身健康需要，硒 的缺乏会对机体造成不良影响。国际学术组织联合会建议成年男女每日膳食硒适宜需要量 分别为40μg和30μg，中国营养学会推荐成人膳食的日摄入量为50～250μg，普遍接受的每日 硒摄入量一般在50～200μg之间，上限为400μg。

由于土壤中硒分布不均的问题，大多数地区 的居民都处于缺硒状态，中国营养学会曾对我国13个省市进行调查，发现成人日平均硒摄 入量为26～32μg，低于所推荐的日摄入量。保证硒在农产品及食品中的含量和质量安全，制 定完善的富硒农产品和食品标准，对我国居民在一定的适宜范围摄入膳食硒，具有科学指 导意义。 [0003] 硒主要有无机硒和有机硒2种形态，不同化学形态硒对人体的吸收、生物效应、毒 性及防癌的作用不同。无机硒主要以四价和六价形式存在，摄入过量会导致急性或慢性中 毒，如硒酸盐或亚硒酸盐会导致生物体发生病变。有机硒在动、植物体内主要以硒蛋白的形 式调控和实现生物学功能，在神经系统发育、免疫功能调节、疾病的预防与治疗等方面起着 重要作用。硒蛋白主要是指硒以硒代半胱氨酸形式通过氨基酸脱水缩合作用结合到肽链上 所形成的复合物。动物体内的硒主要来自于食物，膳食硒蛋白经消化水解为硒代甲硫氨酸 和硒代半胱氨酸，容易被机体吸收。 [0004] 天然富硒农产品中的有机硒如硒蛋白很难被有效提取，为准确检测其硒含量，要 进行消解处理，使有机硒转变为易于检测的无机硒。消解方法有湿法消解、干法灰化消解及 微波消解等。

微波消解操作繁琐，用时较长，样品易损失。干法灰化消解会使食品中的硒以 挥发性化合物的形式损失，导致硒含量检测误差较大，影响检测结果的可靠性。而湿法消解 操作简单，成本低，重现性好，与干法灰化消解相比损失较少。因此如何采用湿法消解来进 行硒含量的分析，进而解决挥发性硒化物的损失，是当前需要解决的问题。 发明内容 [0005] 针对现有技术中存在的不足，本发明提供了一种天然富硒农产品中蛋白硒的检测 方法，操作简便，提取及检测成本低，最大限度地降低了不同性质的物质相互干扰以及基质 的影响，对天然富硒农产品中蛋白硒实现广谱提取及检测。 [0006] 本发明是通过以下技术方案来实现： [0007] 一种天然富硒农产品中蛋白硒的检测方法，包括以下步骤： [0008] 步骤1，将待提取的天然富硒农产品粉碎后，得到粉末，将粉末分为不少于四份后44 CN 113295762 A说明书2/6页 将其中一份按步骤1a处理，得到提取液A； [0009] 步骤1a，使用超纯水对粉末进行超声提取，得到混合体系a，再将混合体系a离心后 分离沉淀，得到沉淀物a和提取液a，将沉淀物a用处理粉末的方式进行处理，得到提取液b， 将提取液b与提取液a合并后得到提取液A； [0010] 将步骤1a中的超纯水分别替换为NaCl溶液、乙醇溶液和NaOH溶液，然后分别重复 步骤1a，对应得到提取液B、提取液C和提取液D； [0011] 步骤2，调节提取液A的pH至水溶性硒蛋白的等电点，之后离心分离得到水溶性硒 蛋白；调节提取液B的pH至盐溶性硒蛋白的等电点，之后离心分离得到盐溶性硒蛋白；调节 提取液C的pH至醇溶性硒蛋白的等电点，之后离心分离得到醇溶性硒蛋白；调节提取液D的 pH至碱溶性硒蛋白的等电点，之后离心分离得到碱溶性硒蛋白； [0012] 步骤3，在水溶性硒蛋白、盐溶性硒蛋白、醇溶性硒蛋白和碱溶性硒蛋白中分别加 入酸解体系进行湿法消解，之后依次赶酸、冷却和定容，分别得到水溶性蛋白硒检测液、盐 溶性蛋白硒检测液、醇溶性蛋白硒检测液、碱溶性蛋白硒检测液； [0013] 步骤4，先将步骤3所述的四种检测液分别采用电感耦合等离子体发射光谱法进行 检测，得到不同的发射光谱强度，将每个发射光谱强度带入硒标准溶液在电感耦合等离子 体发射光谱法下得到的线性回归方程中，得到天然富硒农产品中水溶性蛋白硒、盐溶性蛋 白硒、醇溶性蛋白硒和碱溶性蛋白硒的浓度。

[0014] 优选的，步骤1将所述的天然富硒农产品粉碎后过100目筛，得到粉末。 [0015] 优选的，步骤1中所述的超纯水与粉末的比例为5mL：0.5g；NaCl溶液中NaCl与粉末 的比例为0.25mmol：0.5g；乙醇溶液中乙醇与粉末的比例为3.75mL：0.5g；NaOH溶液中NaOH 与粉末的比例为0.5mmol：0.5g。 [0016] 优选的，步骤1a中所述的超声提取在30～40℃下进行40～60min。 [0017] 优选的，步骤1a中所述的混合体系a在0～4℃下离心。 [0018] 优选的，步骤2使用0.1mol/L的盐酸调节提取液A、提取液B、提取液C和提取液D的 pH。 [0019] 优选的，步骤2中所述的离心均在0～4℃下进行。 [0020] 优选的，步骤3在水溶性硒蛋白、盐溶性硒蛋白、醇溶性硒蛋白和碱溶性硒蛋白中 分别均加入超纯水、硝酸和过氧化氢进行加热，超纯水、硝酸、过氧化氢和步骤1a中粉末的 比例为(10～20)mL：(3～5)mL：(1～3)mL：0.5g，再进行赶酸。 [0021] 进一步，赶酸后所得消化液的体积与超纯水的体积之比为(1～2)：(10～20)。

[0022] 优选的，步骤4采用电感耦合等离子体发射光谱法进行检测时，工作参数如下： [0023] 高频功率为1100～1200w，泵速为40～60rpm，光室温度为30～40℃，重复4～8次。 [0024] 相对于现有技术，本发明具有以下有益的技术效果： [0025] 本发明一种天然富硒农产品中蛋白硒的检测方法，根据蛋白硒中水溶性蛋白硒、 盐溶性蛋白硒、醇溶性蛋白硒和碱溶性蛋白硒的不同性质，分别选择超纯水、NaCl溶液、乙 醇溶液和NaOH溶液进行超声提取，离心后分离沉淀再进行提取得到对应的提取液，再调节 不同提取液的pH至各个硒蛋白的等电点，离心后沉淀可分为水溶性硒蛋白、盐溶性硒蛋白、 醇溶性硒蛋白、碱溶性硒蛋白，分别将水溶性硒蛋白、盐溶性硒蛋白、醇溶性硒蛋白、碱溶性 硒蛋白加入酸解体系进行湿法消解，可得到水溶性蛋白硒、盐溶性蛋白硒、醇溶性蛋白硒、55 CN 113295762 A说明书3/6页 碱溶性蛋白硒，最后依次赶酸、冷却和定容，这样便于采用电感耦合等离子体发射光谱法进 行检测。本发明操作简便，提取及检测成本低，能够准确分离提取出硒蛋白结合形式的农产 品有机硒，且实用性广泛，对不同类型农作物或农产品均有高效的提取效果。

本发明建立的 天然富硒农产品中蛋白硒的提取及检测方法可反映出富硒农产品中硒元素的生物效价及 其毒性信息，不仅对评价和鉴别天然富硒农产品的安全性和质量有重大意义，还对开发新 型富硒食品起到一定促进作用。 附图说明 [0026] 图1为本发明所述检测方法的系统化提取检测流程图。 具体实施方式 [0027] 下面通过具体实施例对本发明原理及优势进行解释和说明，以便本领域技术人员 更好的理解本发明。下述说明仅是示例性的，并不对其内容进行限定。 [0028] 本发明一种天然富硒农产品中蛋白硒的检测方法，利用湿法消解，将天然富硒农 产品中的有机硒提取并转变为易于检测的无机硒，采用线性范围广、精密度好、灵敏度高、 检出限低、干扰小的电感耦合等离子体发射光谱(ICP‑OES)法检测天然富硒农产品中的蛋 白硒，如图1所示，具体包括以下步骤： [0029] 步骤1，对粉碎过筛后的富硒农产品样品进行提取，农产品包括植物产品和动物产 品； [0030] 具体地，富硒农产品打碎成粉过筛，称取四份一定量的粉末于四个锥形瓶中，分别 对应加入一定体积的超纯水、NaCl溶液、乙醇溶液、NaOH溶液后在30～40℃超声提取40～ 60min，提取完成后在0～4℃的低温条件下离心，分别取其上清液，各沉淀物重复上述操作 若干次，得到合并后的上清液，即各提取液，这些提取液分别用于分离水溶性硒蛋白、盐溶 性硒蛋白、醇溶性硒蛋白、碱溶性硒蛋白。

[0031] 步骤2，调节各提取液的pH至硒蛋白的等电点，得到各调节液，将各调节液离心后 分离得到硒蛋白。 [0032] 具体地，分别调节各提取液的pH为4.0、4.3、5.5和4.6至水溶性硒蛋白、盐溶性硒 蛋白、醇溶性硒蛋白、碱溶性硒蛋白的等电点，得到各调节液，将各调节液在0～4℃的低温 条件下离心后分离，分别得到水溶性硒蛋白、盐溶性硒蛋白、醇溶性硒蛋白、碱溶性硒蛋白。 [0033] 步骤3，将得到的各硒蛋白加入酸解体系进行湿法消解，可得到水溶性蛋白硒、盐 溶性蛋白硒、醇溶性蛋白硒、碱溶性蛋白硒。 [0034] 具体地，将得到的水溶性硒蛋白、盐溶性硒蛋白、醇溶性硒蛋白、碱溶性硒蛋白分 别加入10～20mL超纯水、3～5mL硝酸和1～3mL过氧化氢，置于电热板上加热消解，消化液消 解至无色或淡黄色透明溶液同时伴有大量白烟生成，消解完全，赶酸至消化液的体积为1～ 2mL，冷却，分别得到水溶性蛋白硒消化液、盐溶性蛋白硒消化液、醇溶性蛋白硒消化液、碱 溶性蛋白硒消化液。 [0035] 步骤4，采用电感耦合等离子体发射光谱法上机检测。 [0036] 具体地，将得到的水溶性蛋白硒消化液、盐溶性蛋白硒消化液、醇溶性蛋白硒消化 液、碱溶性蛋白硒消化液用超纯水定容至10～25mL，混匀，分别得到水溶性蛋白硒、盐溶性66 CN 113295762 A说明书4/6页 蛋白硒、醇溶性蛋白硒、碱溶性蛋白硒的检测液，采用电感耦合等离子体发射光谱法上机检 测，得到对应的电感耦合等离子体发射光谱强度。

[0037] 下面以富硒黑豆为例进行具体说明。 [0038] 实施例1 [0039] 本发明一种天然富硒农产品中水溶性蛋白硒的检测方法，包括以下步骤： [0040] 步骤1，将富硒黑豆打碎成粉，过100目筛后，称取0.5g于50mL锥形瓶中，加入5mL超 纯水，在40℃下超声提取60min后，在2℃的低温条件离心取上清液，将沉淀重复上述操作， 合并2次提取的上清液用于分离水溶性硒蛋白。 [0041] 步骤2，使用0.1mol/L的盐酸调节提取液的pH至水溶性硒蛋白的等电点4.0，得到 调节液，将调节液在2℃的低温条件离心后分离得到水溶性硒蛋白。 [0042] 步骤3，将得到的水溶性硒蛋白加入20mL超纯水、5mL硝酸、3mL过氧化氢，置于电热 板上加热消解，消化液消解至无色或淡黄色透明溶液同时伴有大量白烟生成，消解完全，赶 酸，继续消解至1mL，冷却，得到水溶性硒蛋白消化液。 [0043] 步骤4，将得到的水溶性硒蛋白消化液用超纯水定容至10mL，混匀，得到水溶性蛋 白硒的检测液，采用电感耦合等离子体发射光谱法上机检测。 [0044] 实施例2 [0045] 本发明一种天然富硒农产品中盐溶性蛋白硒的检测方法，包括以下步骤： [0046] 步骤1，将富硒黑豆打碎成粉，过100目筛后，称取0.5g于50mL锥形瓶中，加入 5mL0.5mol/L的NaCl溶液，在40℃下超声提取60min后，在0℃的低温条件离心取上清液，将 沉淀重复上述操作，合并2次提取的上清液用于分离盐溶性硒蛋白。

[0047] 步骤2，使用0.1mol/L的盐酸调节提取液的pH至盐溶性硒蛋白的等电点4.3，得到 调节液，将调节液在0℃的低温条件离心后分离得到盐溶性硒蛋白。 [0048] 步骤3，将得到的盐溶性硒蛋白加入20mL超纯水、5mL硝酸、3mL过氧化氢，置于电热 板上加热消解，消化液消解至无色或淡黄色透明溶液同时伴有大量白烟生成，消解完全，赶 酸，继续消解至1mL，冷却，得到盐溶性硒蛋白消化液。 [0049] 步骤4，将得到的盐溶性硒蛋白消化液用超纯水定容至10mL，混匀，得到盐溶性蛋 白硒的检测液，采用电感耦合等离子体发射光谱法上机检测。 [0050] 实施例3 [0051] 本发明一种天然富硒农产品中醇溶性蛋白硒的检测方法，包括以下步骤： [0052] 步骤1，将富硒黑豆打碎成粉，过100目筛后，称取0.5g于50mL锥形瓶中，加入 5mL75％的乙醇溶液，在40℃下超声提取60min后，在4℃的低温条件离心取上清液，将沉淀 重复上述操作，合并2次提取的上清液用于分离醇溶性硒蛋白。 [0053] 步骤2，使用0.1mol/L的盐酸调节提取液的pH至醇溶性硒蛋白的等电点5.5，得到 调节液，将调节液在4℃的低温条件离心后分离得到醇溶性硒蛋白。

[0054] 步骤3，将得到的醇溶性硒蛋白加入20mL超纯水、5mL硝酸、3mL过氧化氢，置于电热 板上加热消解，消化液消解至无色或淡黄色透明溶液同时伴有大量白烟生成，消解完全，赶 酸，继续消解至1mL，冷却，得到醇溶性硒蛋白消化液。 [0055] 步骤4，将得到的醇溶性硒蛋白消化液用超纯水定容至10mL，混匀，得到醇溶性蛋 白硒的检测液，采用电感耦合等离子体发射光谱法上机检测。77 CN 113295762 A说明书5/6页 [0056] 实施例4 [0057] 本发明一种天然富硒农产品中碱溶性蛋白硒的检测方法，包括以下步骤： [0058] 步骤1，将富硒黑豆打碎成粉，过100目筛后，称取0.5g于50mL锥形瓶中，加入 5mL0.1mol/L的NaOH溶液，在40℃下超声提取60min后，在1℃的低温条件离心取上清液，将 沉淀重复上述操作，合并2次提取的上清液用于分离碱溶性硒蛋白。 [0059] 步骤2，使用0.1mol/L的盐酸调节提取液的pH至碱溶性硒蛋白的等电点4.6，得到 调节液，将调节液在1℃的低温条件离心后分离得到碱溶性硒蛋白。 [0060] 步骤3，将得到的碱溶性硒蛋白加入20mL超纯水、5mL硝酸、3mL过氧化氢，置于电热 板上加热消解，消化液消解至无色或淡黄色透明溶液同时伴有大量白烟生成，消解完全，赶 酸，继续消解至1mL，冷却，得到碱溶性硒蛋白消化液。

[0061] 步骤4，将得到的碱溶性硒蛋白消化液用超纯水定容至10mL，混匀，得到碱溶性蛋 白硒的检测液，采用电感耦合等离子体发射光谱法上机检测。 [0062] 上述实施例所得的各蛋白的硒含量通过电感耦合等离子体发射光谱法检测，样品 溶液检测前均经0.22μm滤膜过滤。将电感耦合等离子体发射光谱标准溶液用5％的硝酸溶 液逐级进行稀释，配制体积均为10mL，浓度(μg/L)分别为0、25、50、100、200、300的硒标准溶 液绘制标准曲线，在硒元素分析谱线196.0nm下，测定各个标准溶液的电感耦合等离子体发2 射光谱强度y，拟合线性回归方程为y＝0.98x‑1.547，相关系数R ＝0.999，在硒元素分析谱 线203.9nm下，测定各个标准溶液的电感耦合等离子体发射光谱强度y，拟合线性回归方程2元素分析谱线206.2nm下，测定各个标准溶 为y＝1.025x+12.81，相关系数R ＝0.996，在硒 液的电感耦合等离子体发射光谱强度y，拟合线性回归方程为y＝0.921x‑1.315，相关系数 2 R ＝0.990，得到硒蛋白中硒含量。电感耦合等离子体发射光谱法所有仪器参数及工作条件 具体参数列于表1中，富硒黑豆经系统提取后检测结果参见表2。

[0063] 表1电感耦合等离子体发射光谱法工作参数 [0064] [0065] 表2富硒黑豆经不同溶剂系统提取后检测数据88 CN 113295762 A说明书6/6页 [0066] [0067] 由表2可知，在硒元素分析谱线203.9nm下，得到的蛋白硒平均值最大，所以最终结 果以硒元素分析谱线203.9nm下的为准。因此实施例1、实施例2、实施例3和实施例4中水溶 性蛋白硒、盐溶性蛋白硒、醇溶性蛋白硒、碱溶性蛋白硒的平均值分别为25.14μg/100g、 31.10μg/100g、27.78μg/100g、30.02μg/100g。99 CN 113295762 A说明书附图1/1页图11010