天然培养基为什么不需要另加微量元素（微量元素培养基配制）

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如果古代真有这技术，也就不会有“一骑红尘妃子笑，无人知是荔枝来”的感叹。那这连“唐玄宗”都说好的技术究竟是如何操作的呢？

（一）材料准备

全能性表达与细胞分化程度有关。一般说来，细胞的全能性与其分化程度呈负相关，即分化程度高的细胞以及衰老细胞的再生能力低;受精卵分化程度最低，因而全能性最高。由根、下胚轴及茎形成的愈伤组织分化成根的频率较高，由叶或子叶形成的愈伤组织分化成叶的频率较高。由茎端形成的愈伤组织分化成芽与叶的频率亦较高靠近上部的茎段与接近基部的茎段相比能形成较多的花枝和较少的营养枝。一般来说，受精卵、发育中的分生组织细胞、雌雄配子体以及单倍体细胞是较易表达全能性的。常用的消毒剂有70%酒精.次氨酸钙.次氯酸钠，氮化汞CHgCk,升承等。

（二）培养基制备

培养基中含有外植体生长分化所需的营养物质，是外植体温暖的小床。常见的培养基配方如表10-1所示。

制作培养基的物质大致可分为以下六类

1.水 一般用蒸馏水或去离子水配制培养基，煮沸过的自来水也可利用。

2.无机营养 包括氮、磷、钾、钙、镁和硫6种大量元素和铁、锰、铜、锌、氯、硼和钼等微量元素，常将各种元素先配制成母液，储存在4℃冰箱内备用，或在室温下短期存放。

3.有机营养 主要有糖、 氨基酸和维生素，以及天然附加物。糖为培养物提供所需要的碳源，有调节渗透压的作用。常用的是2%-4%的蔗糖，有时也加入葡萄糖和果糖等。

PS:常用的天然附加物有：椰子乳、酵母提取物、玉米胚乳、麦芽浸出物和番茄汁等。它们对愈伤组织的诱导和分化是有益的。

4.植物生长物质 常用的有生长素类和细胞分裂素类，少数培养基中还添加赤霉素等。生长素类(如2,4-D、萘乙酸、吲哚乙酸、吲哚丁酸等)被用于诱导细胞的分裂和根的分化。吲哚乙酸(IAA)易被光和酶氧化分解，所以加入的浓度较高，常为1~30 mg.L-‘,萘乙酸(NAA)、2,4- D的浓度则以0.1~2 mg. I-为宜;细胞分裂素(如激动素、6-苄基腺嘌呤、异戊烯基腺嘌呤、玉米素等)可以促进细胞分裂和诱导愈伤组织或器官分化不定芽，常用的浓度为0.01~1 mg. L-。在初代培养中，–般都需加入植物生长物质，但随着继代培养次数的增加，加入量可逐代减少，最终可做到“激素自养”。

5.琼脂或其他支持物 固体培养时培养物都生长在固体或半固体的培养基上，让培养物处于表面，既能吸收水分和养分，又不致因缺氧而死亡。就目前情况而言，琼脂是一种较为理想的支持物，常用浓度为0.4%~1%，在此浓度下培养基呈透明的固体或半固体状态。然而琼脂凝胶对组织培养也有不利的地方，如:会限制培养基中营养成分和水分的移动，使培养物周围的营养成分逐渐匱乏;植物组织的代谢分泌物，特别是有毒产物积累在培养物的周围，使培养物生长受阻或受到毒害。为了解决这些问题，人们尝试用其他支持物来代替琼脂，滤纸桥法即是一种。该法是将一张较厚的滤纸折叠成M型，放入液体培养基中，将培养的植物组织放在M的中间四陷处，这样培养物可通过滤纸的虹吸作用不断吸收营养和水分;呼吸到足够的氧气;另外，组织的分泌物也不会积累。在此基础上，又发展出了一种类似于“看护”培养的方法，即在滤纸桥的中间凹陷处加一种固体培养基，将材料放在固体培养基上，再把滤纸放入另一种液体培养基中，用两种不同的培养基同时培养材料，可收到较好的效果。也有人尝试用玻璃纤维或人造的聚酯羊毛等作为支持物培养材料。在试验中人们或许能受到一些启发，即培养基中添加琼脂的目的主要是为了支持培养物，只要能达到这个目的，就可选用适宜的材料代替琼脂。需要考虑的问题是，这种材料必须无毒害作用，不被培养物吸收，且不与培养液发生化学反应。

6. 其他添加剂 因培养需要还可在培养基中添加一些特殊成分。如加入活性炭，一方面可以吸附外植体产生的致死性褐化物，促进新梢的形成和伸长，另一方面使培养基变黑，产生类似于土壤的效果，促进根的发育;加入甘露(糖)醇、山梨醇和聚乙二醇等渗透调节剂用以平衡植物细胞和培养基之间的水势;加入庆大霉素等抗生素以防止细菌或真菌对培养基污染;加入半胱氨酸、维生素C、谷胱甘肽等抗氧化剂以减轻外植体伤口溢泌的酚类物质对活细胞的伤害。

（三）灭菌

组织培养必须在严格无菌条件下进行，外植体和培养基一旦被菌污染，培养过程就得终止。因此灭菌是组织培养中必不可少的工作。灭菌方法可分为物理方法和化学方法两类。常用的物理方法有干热(烘烧和灼烧)、湿热(常压或高压蒸煮)、紫外线、超声波、微波、过滤、清洗、冲洗等;常用的化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精等化学药品进行处理。采取的方法和使用的药剂要根据灭菌对象和目的确定。如:培养基用湿热灭菌，也就是高压蒸汽灭菌，将需要灭菌的物品放在高压高温的密闭灭菌锅内，当锅内温度达121℃，气压在0.1~0.15 MPa下，持续15~20 min,就可以杀死各种细菌及其耐热的芽孢。不耐热的物质采用过滤灭菌，一些生长调节剂(如生长素、赤霉素、玉米素、脱落酸)和某些试剂不耐热，受热后会失去药效，可以采用微孔滤膜过滤等方法，即利用压差将配制的溶液通过孔径小于0.45 pum的微孔滤膜，细菌和真菌孢子等因大于滤膜微孔而被阻在滤膜上，而溶液通过滤膜进入无菌瓶内。植物材料表面用消毒剂灭菌，常用的消毒剂有70%~75%酒精、9%~10%次氯酸钙、饱和漂白粉溶液、2%次氯酸钠、0.1%~0. 2%氯化汞等，浸渍材料数分钟就有灭菌效果。材料消毒后需用无菌水充分清洗，以尽量减少消毒剂对外植体的伤害。此外，无菌操作的器械、玻璃器皿及耐热用具采用于热天馆:空间采用紫外线灭菌。

（四）接种

接种是指把消毒过的材料在无菌条件切成小块并放入含有培养基的容器中的过程。接种时一定要严格做到无菌操作，一般在已消毒的接种室、接种箱或超净工作台中进行。

（五）培养

培养是指把培养物 (连灭菌容器) 放在培养室里，使之分化、分裂和生长，形成愈伤组织，分化器官，进而再生植株的过程。

培养温度一般控制在 (25+2)℃，低于15C时，植物组织会停止生长，高于35C对植物生长不利。每天光照约16h, 光强为100~-400，一般来说，光照强，幼苗生长粗壮。

1、初代培养：是指接种某些外植体后，最初的几代培养。

2、继代培养：是继初代培养之后的连续数代的扩大繁殖培养过程。在初代培养的基础上所获得的芽、苗、胚状体和原球茎等，数量都还少，它们需要进一步增殉。继代培养的目的在于繁殖出相当数量的无根苗。

3、生根培养：是使无根苗生根的过程。继代培养只是储备或增殖培养物，而生根才能使增殖材料成为完整植株。器官形成过程中一般先出现芽，后形成根。如果先出现根则会抑制芽的发生，对成苗不利。生根培养基一般用1/2或1/4的MS培养基，再添加低浓度的生长素而不加细胞分裂素。

（六）驯化与移栽

组织培养苗又称为试管苗，由于它是在无菌、营养供给充足、温度适宜、相对湿度近100%、光照偏弱的环境条件下长成的，因此试管苗在生理、 形态等方面都与自然条件下生长的小苗有着很大的差异，表现为植株瘦长，含水量高， 角质层不发达，光合能力低，抗送性差。必须通过控水、减肥、增光、降温等驯化处理使试管苗逐渐地适应自然环境。当驯化过的试管苗具有4~5条根后，即可移栽。移栽时先将小苗根部的培养基洗去，以免细菌繁殖污染。苗床土可采用沙性较强的菜园土，或用泥炭土、珍珠岩、蛭石、砻糠灰等配制的混合培养土。新栽的苗要用塑料薄膜覆盖，并经常通气。小苗长出新叶后，去掉薄膜就能成为正常的田间植株。