儿童微量元素正常值表（儿童微量元素数值）

人体内的微量元素含量处于动态平衡中, 缺乏和过量都会对人体产生不良影响。人体铁（iron, Fe）、镁（magnesium, Mg）、钙（calcium, Ca）、锌（zinc, Zn）、铜（copper, Cu）元素水平的高低与很多疾病及健康息息相关, 如精神分裂、动脉粥样硬化、阿兹海默症、早产风险[、新生儿健康、弗里德赖希共济失调、慢性疾病、抗氧化保护等。如何快速、准确地检测人体微量元素水平, 进而推断与疾病的相关性成为临床亟待解决的问题。目前, 检测微量元素的方法有原子吸收光谱法（atomic absorption spectroscopy, AAS）、电感耦合等离子体原子发射光谱法（inductively coupled plasma atomic emission spectrometry, ICP-AES）、电感耦合等离子体质谱法（inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS）等。其中ICP-MS以其线性范围宽、检测敏感性高、可同时测定多种元素、基质效应低等特点受到普遍关注。我们拟建立ICP-MS同时检测全血中Fe、Mg、Ca、Zn、Cu 5种元素的方法, 探讨ICP-MS用于临床大样本检测的可行性。

1 材料和方法

1.1 仪器和试剂

安捷伦7700x电感耦合等离子体质谱仪（美国安捷伦科技有限公司）、BY-400C型医用离心机（北京白洋医疗器械有限公司）、BSA224S-CW型分析天平（德国赛多利斯科学仪器有限公司）、优普超纯水仪（成都超纯科技有限公司）、快速混匀器（江苏新康医疗器械有限公司）、Thermo Scientific可调移液器（美国Thermo公司）等。硝酸（超纯级, 苏州晶瑞化学股份有限公司）、Triton 100（美国西格玛奥德里奇贸易有限公司）。Fe、Mg、Ca、Zn、Cu标准品（可溯源至中国计量科学研究院）及内标品锗（germanium, Ge）由国家有色金属及电子材料分析检测中心提供, 浓度均为1 000 μ g/mL。1 μ g/L调谐液（铈、钴、锂、Mg、铊、钇混合液, 美国安捷伦科技有限公司）

1.2 方法

1.2.1 仪器准备 仪器按正常程序开机, 抽真空, 然后在待机情况下进行仪器维护, 点火调谐, 性能验证成功后进行批处理调谐。相关工作参数：载气流速为0.35 L/min, 气流速为0.61 L/min; 等离子体模式, 高基质系统; 等离子体气流速为15 L/min; 采样深度为10 mm; 射频功率为1 550 W; 提取透镜为-200 V; Omega透镜电压为11.0 V; Omega偏转电压为-70 V; 积分时间为0.1 s; 重复次数为3次; 蠕动泵流速为0.1 r/min; 氦气流速为5 L/min。在批处理调谐相关参数达到分析要求[质量轴± 0.1、每秒计数值（counts per second, CPS）> 2 400、氧化物< 1%, 双电荷< 3%]后开始正常分析程序。

1.2.2 采样前相关试剂及系统准备 进样分析前分别对系统中可能引起污染的部件, 如雾化器、雾化池、炬管及锥进行浸泡清洗, 更换管线, 每个样本采集结束后分别切换至进样口冲洗、稀硝酸溶液及超纯水清洗, 相关试剂均用超纯水稀释至对应浓度后进样检测, 考察各个元素的干扰情况。每个批次分析前分别进样超纯水及稀释液, 排除空白干扰之后再进行样本分析。

1.2.3 稀释液配制 分别移取2.5 mL硝酸及0.5 mL Triton 100至500 mL容量瓶中, 用超纯水定容至刻度, 然后转移至聚丙稀瓶中, 得到含0.5%硝酸、0.1%Triton 100的稀释液, 储存于4 ℃冰箱中待用。

1.2.4 标准应用液配制 分别移取不同体积的标准品母液, 参照全血样本中不同目标元素水平进行配制, 分别得到混合标准品母液, 其中Fe、Mg、Ca、Zn、Cu水平分别为500、50、125、12.5、3.125 μ g/mL。同样移取适量内标品配制得到0.5 μ g/mL 内标液, 然后分别移取2.5、5、10、20、40 μ L母液, 加入20 μ L内标液, 然后分别定容至1 mL, 得到S1、S2、S3、S4、S5 5个浓度, 待用。

1.2.5 样本稀释准备 将全血样本充分混匀, 然后准确移取20 μ L全血样本, 加入20 μ L内标液, 再加入960 μ L含0.5%硝酸、0.1%Triton 100的稀释液, 定容至1 mL, 充分混匀, 采用蠕动泵连续进样, 采集时间为0.1 s。

1.3 方法学评价

1.3.1 线性评价 将混合标准应用液S1~S5按正常程序进行处理并进样分析, 观察Fe、Mg、Ca、Zn、Cu 5种元素标准曲线的线性。

1.3.2 基质效应及相关干扰 分别准备2个水平的混合标准品（C1）, C1为理论浓度, 进样分析得到一个检测值C2。将同样水平的标准品加入全血样本中, 检测得到加入量C3, 分别进样。平行检测6份样本, 计算C1、C2与C3的相对标准偏差, 即目标元素在纯稀释液中与在全血基质中结果的差异, 评价基质干扰程度。每批标准应用液检测结束之后进样分析空白稀释液, 如果采集记数超过最低点计数的20%则继续进行空白稀释液分析, 直至残留干扰达到S1点的20%以内。

1.3.3 精密度 分别准备低、中、高水平混合全血样本, 进行6次重复处理后进样分析, 检测5种元素的水平, 观察批内重复性[以变异系数（coefficient of variation,CV）表示]; 准备低、中、高水平全血样本, 分3批进行6次重复处理（分3 d, 每天2批）, 进样分析, 检测5种元素的水平, 观察批间重复性（以CV表示）。

1.3.4 添加回收试验 将1份混合全血样本平行测定20次, 求得本底值L1, 在此基础上添加中水平和高水平标准品得到L2和L3, 然后分别检测L2和L3各元素的水平及对应的添加回收率。

1.3.5 室间比对试验 分别准备3个不同水平的全血样本（C1、C2、C3）, 每个水平进行6次进样检测, 将本实验室的测定结果与安捷伦科技（中国）有限公司上海分公司实验室（简称安捷伦实验室）的安捷伦7700x电感耦合等离子体质谱仪的测定结果进行比对, 观察不同实验室间结果的差异。

1.3.6 参考区间的建立 选取2016年7月杭州地区体检正常者495名, 其中男242名、女253名, 年龄2~50岁。按年龄分为≤ 16岁组（254名）和> 16岁组（241名）。采用肝素钠抗凝真空采血管采集静脉全血样本, 充分摇匀, 2~8 ℃保存待测, 采用ICP-MS检测5种元素, 建立正常人群的参考区间。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计分析。正态性检验结果显示所有数据均呈正态分布, 以x±s表示, 组间比较采用t检验, 以x± 2s方式建立参考区间。以P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 线性评价及最低定量限（limit of quantitation, LOQ）

以标准点浓度为X, 对应元素CPS与内标CPS比率为Y, 建立线性回归方程,r值为0.999 6~1.000 0。5种元素线性均良好。见表1。

表15种元素线性回归方程及线性范围

重复检测超纯水11次, 计算标准偏差, 以10倍标准偏差作为该法的LOQ, 见表1。

2.2 基质效应

相对标准偏差范围为0.7%~6.0%, 稀释之后基质对检测结果基本无影响。见表2。

表25种元素基质效应分析

2.3 精密度验证

采用ICP-MS检测低、中、高水平样本, Fe、Mg、Ca、Zn、Cu的批内CV为0.31%~3.62%, 批间CV为1.37%~7.15%。见表3。

表35种元素批内、批间CV结果 （%）

2.4 添加回收试验

将L2、L3处理后分别检测6次, 求得L2、L3均值, Fe、Mg、Ca、Zn、Cu对应的添加回收率为98.2%~112.7%, 符合要求（100%± 20%）。见表4。

表4添加回收试验结果

2.5 室间比对分析

本实验室测定结果与安捷伦实验室的平均相对偏差为0.61%~5.56%, 本方法准确度满足要求, 可用于大样本分析。见表5。

表5室间比对分析结果

2.6 临床应用及参考区间统计

男、女性之间5种元素差异均无统计学意义（P> 0.05）。按年龄划分为未成年组（≤ 16岁）和成年组（> 16岁）, 成年组与未成年组比较差异均有统计学意义（P< 0.05）。未成年组Cu元素比成年组低1.0%, Ca元素比成年组高8.5%, Mg元素比成年组高4.3%, Fe元素比成人组低2.4%, Zn元素比成年组低24.4%。以x± 2s计算参考区间。见表6、表7。

表6成年组与未成年组Mg、Ca、Fe、Cu 、Zn结果的比较 （mg/L,x±s）

表7Mg、Ca、Fe、Cu、Zn的参考区间 （mg/L）

3 讨论

随着人们对营养要求关注的增加, 各种食品中或多或少会添加单一元素或复合元素, 以补充人体所需的微量元素。本研究结果显示, 未成年人Zn水平相对较低, 与文献报道一致, 因此需引起临床重视, 但也不可盲目补充, 应结合相应检测结果适当地进行控制或补充。

ICP-MS是20世纪80年代发展起来的较新的检测技术, 其将ICP的高温电离特性与四极杆质谱的高敏感性相结合, 形成一种新型的同位素分析、元素分析和形态分析技术, 具有检出线性范围宽、检出限低、干扰因素少、基质效应低、分析精密度高、分析速度快等特性, 广泛应用于环境、化工、食品、医学等多个领域。本研究结果显示, ICP-MS检测全血Fe、Mg、Ca、Zn、Cu的线性关系良好, 批内、批间精密度均符合临床检测要求, 同时还初步建立了杭州地区未成年人与成年人全血5种元素的参考区间。

综上所述, ICP-MS具有敏感性高、抗干扰能力强、准确度高及稳定性好的优点, 可同时检测Fe、Mg、Ca、Zn、Cu元素, 而且临床适用性较好, 可为临床相关疾病的诊断提供参考依据。

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