农产品中硒含量（富硒农产品硒含量标准）
本发明属于食品领域，涉及一种测定富硒水果中五种硒的检测方法。
背景技术：
目前硒的检测国家标准主要有gb5009.93-2017《食品中硒的测定》，该方法是对食品中总硒的测定，不能对硒的形态进行分析，从而不能正确的了解和评价富硒水果中硒的形态分布，以及对人体健康的作用。
本发明建立了以柠檬酸(2g/l)为提取试剂，恒温水域振荡法作为提取方法，样品溶液经离子色谱(ic)分离后，用电感耦合等离子体质谱法(icp-ms)测定，方法简单快速，可以测定富硒水果中两种无机硒和三种有机硒。
技术实现要素：
由于水果中硒含量较低，硒形态难以提取。针对现有技术存在的问题，本发明提供一种同时测定富硒水果中五种硒形态的检测方法，解决了富硒水果中硒形态的提取和检测的技术问题，将方法检出限提高了近10倍，提取率也有了较大提升。
为了达到上述目的，本发明采用检测步骤如下：
一种同时测定富硒水果中五种硒形态的检测方法，包括以下步骤：
(1)配制溶液
①2g/l柠檬酸溶液：称取2g柠檬酸，用水稀释至1000ml；
②1g/l柠檬酸溶液：称取1g柠檬酸，用水稀释至1000ml。
(2)配制标准溶液
①五种硒的标准品：纯度＞99％的硒代氨基酸标准品，包括硒代胱氨酸[secys2]、硒代半胱氨酸[secys]、硒代蛋氨酸[semet]。浓度为1000mg/l的亚硒酸根标准溶液[se(iv)]、硒酸根标准溶液[se(vi)]；
②混合标准中间液：分别准确称取亚硒酸根标准溶液[se(iv)]、硒酸根标准溶液[se(vi)]和硒代氨基酸标准品适量，配置成浓度为1mg/l的硒混合标准储备液(以硒计)；
③基质匹配混合标准工作溶液：分别准确吸取混合标准中间液各0.25ml、0.5ml、1ml、2ml、4ml于50ml容量瓶中，用1g/l柠檬酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为系列基质匹配标准工作溶液，硒标准溶液浓度依次为5μg/l、10μg/l、20μg/l、40μg/l、80μg/l。
(3)样品的前处理方法(制备样品溶液)
①样品预处理：将富硒水果样品清洗干净，粉碎后在-40℃冷冻干燥机冷冻干燥，干燥后的样品研磨成粉后备用。
②样品溶液的制备：称取干燥后的样品0.5g于刻度离心管中，加入20ml柠檬酸(2g/l)混匀，置于50℃恒温水浴中振荡提取4h后，取出后定容至25ml，于10000r/min下离心10min，收集上清液5ml加入正己烷1ml涡旋混合，收集水相试液过0.22μm水膜后备用。
(4)离子色谱-电感耦合等离子体质谱分析参考条件
①离子色谱分离条件
流动相：称取1.0g柠檬酸溶于1000ml水中，用氨水调ph至5.0，再加入10ml甲醇，于水浴中超声脱气10min，备用。色谱柱：阴离子交换柱hamiltonprpx100(250mm×4mm)。流速：1.0ml/min。进样体积：50μl。
②电感耦合等离子体质谱仪器条件
射频功率：1550w；采样深度：9mm；采集质量数：se78；载气流速：0.7l/min；辅助气流速：0.48l/min；积分时间：0.5s。
(5)定性分析
按照离子色谱-电感耦合等离子体质谱仪器条件测定步骤(2)配制的基质匹配混合标准工作溶液和步骤(3)制备的样品溶液，记录标准工作溶液和样品溶液中各化合物的色谱保留时间，当样品溶液中检出与标准溶液中五种硒色谱保留时间一致的色谱图，可以确定样品中检出对应的化合物。部分样品色谱保留时间可能会发生较小的偏移，从而难以通过保留时间来定性是哪种硒化合物，这种情况下可通过样品中加入该种硒化合物标准溶液进行上机测定，如果样品未知色谱峰与已知的硒化合物标准溶液色谱峰重合在一起，可定性为该种硒化合物。
(6)定量测定
①将基质匹配混合标准工作溶液分别按仪器参考条件进行测定，得到相应的标准溶液的色谱峰面积，以保留时间t/min为横坐标，响应色谱峰面积i/cps为纵坐标，绘制标准曲线，以样品溶液色谱图中对应的峰面积通过标准曲线计算各硒形态的含量。
样品溶液中目标物的含量，用标准曲线外标法定量，计算公式如下：
式中：x—样品中各硒化合物的含量，mg/kg；
c—样品溶液中各硒化合物的浓度，μg/l；
v—样品溶液定容体积，ml；
m—样品称样质量，g；
k—稀释倍数。
计算结果保留三位有效数字。
②本方法五种硒的线性范围为5～100μg/l；硒代胱氨酸[secys2]、硒代半胱氨酸[secys]、亚硒酸根[se(iv)]、硒代蛋氨酸[semet]、硒酸根[se(vi)]的检出限分别为：0.5μg/l、0.8μg/l、0.6μg/l、1.2μg/l、0.6μg/l。
本发明的有益效果为:
(1)采用离子色谱(ic)与电感耦合等离子质谱(icp-ms)联用进行分析和检测，五种硒形态的硒在15分钟内能够同时被定性和定量分析，较现有方法分析时间短；
(2)前处理采用冷冻干燥技术，能够充分的破坏植物的细胞壁，提升了提取效率，同时还能防止硒的形态发生迁移和转化，将检出限提高了近10倍，解决了水果中硒含量过低难以检测的问题；
(3)采用柠檬酸-氨水缓冲盐流动相体系，能够保证硒形态稳定，同时采用柠檬酸(2g/l)，50℃水浴振荡体系提取，在保证硒形态稳定的前提下，能够最大的提升提取率，改善了硒代蛋氨酸semet再超声波提取下结构易发生断裂，回收率低的问题；
(4)本发明具有试剂用量少、操作简单、提取率高、检出限低、稳定性好、检测准确等特点，解决和弥补现有检测方法的不足，达到痕量元素形态分析的要求。
附图说明
图1为五种硒的色谱图，从左到右色谱峰依次为硒代胱氨酸[secys2]、硒代半胱氨酸[secys]、亚硒酸根[se(iv)]、硒代蛋氨酸[semet]、硒酸根[se(vi)]；
图2为硒代胱氨酸[secys2]标准曲线，浓度依次为5μg/l、10μg/l、20μg/l、40μg/l、80μg/l；
图3为硒代半胱氨酸[secys]标准曲线，浓度依次为5μg/l、10μg/l、20μg/l、40μg/l、80μg/l；
图4为亚硒酸根[se(iv)]标准曲线，浓度依次为5μg/l、10μg/l、20μg/l、40μg/l、80μg/l；
图5为硒代蛋氨酸[semet]标准曲线，浓度依次为5μg/l、10μg/l、20μg/l、40μg/l、80μg/l；
图6为硒酸根[se(vi)]标准曲线，浓度依次为5μg/l、10μg/l、20μg/l、40μg/l、80μg/l；
图7为不含五种硒的空白苹果样品色谱图；
图8为富硒苹果样品的色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实例1富硒苹果中五种硒形态的测定
(1)样品前处理
①样品预处理：将富硒苹果样品清洗干净，粉碎后在-40℃冷冻干燥机冷冻干燥，干燥后的样品研磨成粉后备用。
②样品溶液的制备：称取干燥后的样品0.5g于刻度离心管中，加入20ml柠檬酸(2g/l)混匀，置于50℃恒温水浴中振荡提取4h后，取出后定容至25ml，于10000r/min下离心10min，收集上清液5ml加入正己烷1ml涡旋混合，收集水相试液过0.22μm水膜后备用。
(2)离子色谱-串联质谱分析参考条件
①离子色谱分离条件
流动相：称取1.0g柠檬酸溶于1000ml水中，用氨水调ph至5.0，再加入10ml甲醇，于水浴中超声脱气10min，备用。色谱柱：阴离子交换柱hamiltonprpx100(250mm×4mm)。流速：1.0ml/min。进样体积：50μl。
②电感耦合等离子体质谱仪器条件
射频功率：1550w；采样深度：9mm；采集质量数：78(se)；载气流速：0.7l/min；辅助气流速：0.48l/min；积分时间：0.5s。
(3)标准溶液的配制
①五种硒的标准品：纯度＞99％的硒代氨基酸标准品，包括硒代胱氨酸[secys2]、硒代半胱氨酸[secys]、硒代蛋氨酸[semet]。浓度为1000mg/l的亚硒酸根标准溶液[se(iv)]、硒酸根标准溶液[se(vi)]；
②混合标准中间液：分别准确称取亚硒酸根标准溶液[se(iv)]、硒酸根标准溶液[se(vi)]和硒代氨基酸标准品适量，配置成浓度为1mg/l的硒混合标准储备液(以硒计)；
③基质匹配混合标准工作溶液：分别准确吸取混合标准中间液各0.25ml、0.5ml、1ml、2ml、4ml于50ml容量瓶中，用1g/l柠檬酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为系列基质匹配标准工作溶液，硒标准溶液浓度依次为5μg/l、10μg/l、20μg/l、40μg/l、80μg/l。
(4)定量测定
将基质匹配混合标准工作溶液分别按仪器参考条件进行测定，得到相应的标准溶液的色谱峰面积，以保留时间t/min为横坐标，响应色谱峰面积i/cps为纵坐标，绘制标准曲线，以以样品溶液色谱图中对应的峰面积通过标准曲线计算各硒形态的含量。
样品溶液中目标物的含量，用标准曲线外标法定量，计算公式如下：
式中：x—样品中各硒化合物的含量，mg/kg；
c—样品溶液中各硒化合物的浓度，μg/l；
v—样品溶液定容体积，ml；
m—样品称样质量，g；
k—稀释倍数。
计算结果保留三位有效数字。
(5)加标回收率和重复性
分别在对照空白(不富硒的样品)中加入5μg/l、20μg/l、50μg/l三个浓度水平进行加标回收试验(n＝3)。
表2加标回收实验
tab2additionrecoverytest
表2表明，三个加标水平的平均回收率在82％以上，相对标准偏差小于7％，实验数据表明本实例方法回收率与重复性均符合检测方法要求。
实例2富硒樱桃中无机硒和有机硒的测定
(1)样品前处理
①样品预处理：将富硒樱桃样品清洗干净，粉碎后在-40℃冷冻干燥机冷冻干燥，干燥后的样品研磨成粉后备用。
②样品溶液的制备：称取干燥后的样品0.5g于刻度离心管中，加入20ml柠檬酸(2g/l)混匀，置于50℃恒温水浴中振荡提取4h后，取出后定容至25ml，于10000r/min下离心10min，收集上清液5ml加入正己烷1ml涡旋混合，收集水相试液过0.22μm水膜后备用。
(2)离子色谱-串联质谱分析参考条件
①离子色谱分离条件
流动相：称取1.0g柠檬酸溶于1000ml水中，用氨水调ph至5.0，再加入10ml甲醇，于水浴中超声脱气10min，备用。色谱柱：阴离子交换柱hamiltonprpx100(250mm×4mm)。流速：1.0ml/min。进样体积：50μl。
②电感耦合等离子体质谱仪器条件
射频功率：1550w；采样深度：9mm；采集质量数：78(se)；载气流速：0.7l/min；辅助气流速：0.48l/min；积分时间：0.5s。
(3)标准溶液的配制
①硒标准品：浓度为1000mg/l的亚硒酸根标准溶液[se(iv)]、硒酸根标准溶液[se(vi)]；
②混合标准中间液：分别准确称取亚硒酸根标准溶液[se(iv)]、硒酸根标准溶液[se(vi)]标准溶液适量，配置成浓度为1mg/l的硒混合标准储备液(以硒计)；
③基质匹配混合标准工作溶液：分别准确吸取混合标准中间液各0.25ml、0.5ml、1ml、2ml、4ml于50ml容量瓶中，用1g/l柠檬酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为系列基质匹配标准工作溶液，浓度依次为5μg/l、10μg/l、20μg/l、40μg/l、80μg/l。
(4)无机硒(亚硒酸根[se(iv)]、硒酸根[se(vi)])定量测定
将基质匹配混合标准工作溶液分别按仪器参考条件进行测定，得到相应的标准溶液的色谱峰面积，以保留时间t/min为横坐标，响应色谱峰面积i/cps为纵坐标，绘制标准曲线，以样品溶液色谱图中对应的峰面积通过标准曲线计算各硒形态的含量。
样品溶液中目标物的含量，用标准曲线外标法定量，计算公式如下：
式中：x—样品中各硒化合物的含量，mg/kg；
c—样品溶液中各硒化合物的浓度，μg/l；
v—样品溶液定容体积，ml；
m—样品称样质量，g；
k—稀释倍数。
计算结果保留三位有效数字，测得该样品无机硒含量(以干基计)为0.122mg/kg。
(5)总硒的测定：称取冻干后的樱桃样品0.3g置于消解罐中，加入5ml硝酸和2ml双氧水，进行微波消解。消解完成后在电热板赶酸至1ml，然后转移至50ml的容量瓶中采用电感耦合等离子体质谱直接测定，测得樱桃样品总硒(以干基计)含量为0.367mg/kg。
(6)有机硒的含量：有机硒的含量为总硒含量减去无机硒含量，0.367mg/kg-0.122mg/kg＝0.245mg/kg，因此，测得樱桃中有机硒的含量(以干基计)为0.245mg/kg，该樱桃有机硒占总硒比为66.8％。
以上所述实施例仅表达本发明的实施方式，但并不能因此而理解为对本发明专利的范围的限制，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些均属于本发明的保护范围。
技术特征：
1.一种同时测定富硒水果中五种硒形态的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)配制溶液
①2g/l柠檬酸溶液；
②1g/l柠檬酸溶液；
(2)配制标准溶液
①五种硒的标准品：纯度＞99％的硒代氨基酸标准品，包括硒代胱氨酸[secys2]、硒代半胱氨酸[secys]、硒代蛋氨酸[semet]；浓度为1000mg/l的亚硒酸根标准溶液[se(iv)]、硒酸根标准溶液[se(vi)]；
②混合标准中间液：分别准确称取亚硒酸根标准溶液[se(iv)]、硒酸根标准溶液[se(vi)]和硒代氨基酸标准品适量，配置成硒浓度为1mg/l的硒混合标准储备液；
③基质匹配混合标准工作溶液：分别准确吸取混合标准中间液各0.25ml、0.5ml、1ml、2ml、4ml于50ml容量瓶中，用1g/l柠檬酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为系列基质匹配标准工作溶液，硒标准溶液浓度依次为5μg/l、10μg/l、20μg/l、40μg/l、80μg/l；
(3)样品的前处理方法
①样品预处理：将富硒水果样品清洗干净，粉碎后在-40℃冷冻干燥机冷冻干燥，干燥后的样品研磨成粉后备用；
②样品溶液的制备：称取干燥后的样品0.5g于离心管中，加入2g/l的柠檬酸混匀，置于50℃恒温水浴中振荡提取4h后，于10000r/min下离心10min，收集上清液5ml加入正己烷1ml涡旋混合，收集水相试液过0.22μm水膜后备用；
(4)离子色谱-电感耦合等离子体质谱分析参考条件
①离子色谱分离条件
流动相：称取1.0g柠檬酸溶于1000ml水中，用氨水调ph至5.0，再加入10ml甲醇，于水浴中超声脱气10min，备用；色谱柱：阴离子交换柱hamiltonprpx100(250mm×4mm)；流速：1.0ml/min；进样体积：50μl；
②电感耦合等离子体质谱仪器条件
射频功率：1550w；采样深度：9mm；采集质量数：se78；载气流速：0.7l/min；辅助气流速：0.48l/min；积分时间：0.5s；
(5)定性分析
按照离子色谱-电感耦合等离子体质谱仪器条件测定步骤(2)配制的基质匹配混合标准工作溶液和步骤(3)制备的样品溶液，记录标准工作溶液和样品溶液中各化合物的色谱保留时间，当样品溶液中检出与标准溶液中五种硒色谱保留时间一致的色谱图，能够确定样品中检出对应的化合物；当部分样品色谱保留时间发生偏移时，通过样品中加入该种硒化合物标准溶液进行上机测定，如果样品未知色谱峰与已知的硒化合物标准溶液色谱峰重合在一起，则定性为该种硒化合物；
(6)定量测定
①将基质匹配混合标准工作溶液分别按仪器参考条件进行测定，得到相应的标准溶液的色谱峰面积，以保留时间t/min为横坐标，响应色谱峰面积i/cps为纵坐标，绘制标准曲线，以样品溶液色谱图中对应的峰面积通过标准曲线计算各硒形态的含量；
样品溶液中目标物的含量，用标准曲线外标法定量，计算公式如下：
式中：x—样品中各硒化合物的含量，mg/kg；
c—样品溶液中各硒化合物的浓度，μg/l；
v—样品溶液定容体积，ml；
m—样品称样质量，g；
k—稀释倍数；
计算结果保留三位有效数字；
②五种硒的线性范围为5～100μg/l；硒代胱氨酸[secys2]、硒代半胱氨酸[secys]、亚硒酸根[se(iv)]、硒代蛋氨酸[semet]、硒酸根[se(vi)]的检出限分别为：0.5μg/l、0.8μg/l、0.6μg/l、1.2μg/l、0.6μg/l。
技术总结
一种同时测定富硒水果中五种硒形态的检测方法，属于食品领域。首先，将样品在‑40℃以下冷冻干燥，充分使植物细胞破壁，保持水果中硒形态不发生变化，硒的不同形态能够被充分提取；其次，建立以0.2％柠檬酸为提取剂，50℃水浴振荡提取4h的提取方法；最后，建立以0.1％柠檬酸‑氨水为流动相体系(pH＝5),离子色谱‑电感耦合等离子体质谱法联用(IC‑ICP‑MS)同时测定富硒水果中5种硒形态的检测方法。本发明对富硒水果中硒元素的来源，及在水果中的富集、转换和迁移有重要意义，目前国家标准尚无针对具体硒形态的检测技术标准。另外，本发明具有试剂用量少、操作简单、提取率高、分析时间短、检出限低、稳定性好、检测准确等特点，解决和弥补现有检测方法的不足。
技术研发人员：赵彤;周慧敏;王聪
受保护的技术使用者：大连市检验检测认证技术服务中心
技术研发日：2020.03.10
技术公布日：2020.06.16
