纳米活性硒产品（纳米活性产品硒含量多少）
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利(10)授权公告号(45)授权公告日(21)申请号2.X(22)申请日2018.01.23(65)同一申请的已公布的文献号申请公布号CN107881127(43)申请公布日2018.04.06(83)生物保藏信息CCTCC20165782016.10.18(73)专利权人陕西省微生物研究所地址710043陕西省西安市西影路76号(72)发明人(74)专利代理机构西安新思维专利商标事务所有限公司61114代理人(51)Int.Cl.C12N1/20(2006.01)C12P3/00(2006.01)C12R1/07(2006.01)(56)对比文件CN106190905A,2016.12.07CN105420280A,2016.03.23CN106566788A,2017.04.19ChaoSong等.Enhancedconversionbiosyntheticseleniumnanoparticlesusingfetalbovineserum.《RSCAdvances》.2016,第6卷(第106期)103948-103954页.SoniyaDhanjal等.AerobicbiogenesisseleniumnanospheresBacilluscereusisolatedfromcoalminesoil.《MicrobialCellFactories》.2010,第9卷(第52期),第1-11页.审查员(54)发明名称一种解淀粉芽孢杆菌Lxz-41及利用该菌株可控制备纳米硒的方法(57)摘要本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌Lxz‑41及利用该菌株可控制备纳米硒的方法。
该解淀粉芽孢杆菌LM2016578，保藏在中国典型培养物保藏中心，该菌株具有可控生产纳米硒的能力。本发明以解淀粉芽孢杆菌Lxz‑41作为发酵菌株，流加硒酸盐，控制菌株培养时间、转速、表面活性剂浓度来可控制备纳米硒，收集发酵液沉淀，纯化后得到纳米硒颗粒。本发明菌株耐高浓度的亚硒酸盐，通过制备过程条件的控制能够使产生的大部分的纳米硒颗粒粒径在200nm以下。本发明的可控纳米硒制备方法能够减轻硒酸盐对菌体生长的抑制作用，增加纳米硒的转化率，有效控制纳米硒颗粒的结团现象，且所需的培养基和培养条件简单、成本低、易操作适合于大规模的发酵罐生产。权利要求书1页说明书9页序列表1页附图5页CN1078811271.一种解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）Lxz‑41，保藏编号为：CCTCCNO：M2016578，保藏在中国典型培养物保藏中心，该菌株具有可控生产纳米硒的能力。2.一种利用权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）Lxz‑41可控生产纳米硒的方法，其特征在于，包含以下步骤:S1.菌种活化：将保藏菌株接于牛肉膏蛋白胨或LB试管琼脂斜面培养基上，25‑40静止培养活化，待菌落长满斜面；S2.种子培养：将斜面培养菌种接种于含有硒盐的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，装液量为容器容量的20%，25‑40、80‑200r/min振荡培养12‑24h，得种子液；S3.纳米硒可控生产：将种子培养液按照1%‑5%接种量接种至装有发酵培养基的发酵容器中，所述发酵培养基中包括硒盐，硒盐采用流加形式加入，发酵培养基装液量为发酵容器容量的40%‑70%，搅拌速率50‑200r/min、通气量0.5‑2.0vvm，温度保持25‑40，发酵时间24‑72h；S4.纳米硒提取纯化：发酵液下罐，4000‑10000r/min4冷冻离心10‑20min，收集得到菌体，用约1/4发酵液体积无菌生理盐水冲洗三次，用约1/20体积无菌蒸馏水进行悬浮，进行冰浴超声破壁20‑40min，菌体裂解液4000‑10000r/min4冷冻离心10‑20min，沉淀用同体积去离子水清洗三次，并用约1/2体积蒸馏水悬浮，得到纳米硒悬液，加入同体积氯仿进行萃取30min，萃取2‑3次，合并下层水相，用均质机均质2‑5min，4000‑10000r/min4冷冻离心10‑20min，沉淀用等体积无菌生理盐水清洗3次，冷冻干燥即得微生物纳米硒。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，S2中牛肉膏蛋白胨液体培养基中的硒盐为亚硒酸盐、硒酸盐中的一种或几种，质量体积比为100‑500mg/L。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，对S2、S3培养基中的硒盐进行单独灭菌，然后加入到灭菌后的培养基中。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，S3中发酵培养基组分为（g/L）：葡萄糖10，蛋白胨5，硫酸铵1，七水硫酸镁0.3，磷酸二氢钾0.5，磷酸氢二钾0.5，氯化钠2，硒盐0.1‑4.5，表面活性剂0.5‑1，pH=7.2‑7.4。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，S3中发酵培养基中的硒盐用母液分批流加形式或连续流加形式，以控制发酵液中硒盐的浓度，进而控制菌株的转化效率，所述硒盐为亚硒酸盐、硒酸盐中的一种或几种。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，发酵培养基中分批流加或连续流加亚硒酸钠，所用亚硒酸钠母液的浓度为50‑500g/L。8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，S4中超声破碎功率400W‑1000W,频率20‑40KHz，启停间隔10‑15s，破碎20‑40min。9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述表面活性剂为SDS、吐温40、吐温60、吐温80中的一种或几种。
10.含有权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌Lxz‑41的复合微生物菌剂。CN107881127一种解淀粉芽孢杆菌Lxz‑41及利用该菌株可控制备纳米硒的方法技术领域[0001]本发明属于微生物应用技术及纳米硒制备领域，具体是涉及一种解淀粉芽孢杆菌Lxz‑41及利用该菌株可控制备纳米硒的方法。背景技术[0002]硒是生态系统中非常重要的营养元素，有着“生命元素”之称。早在1957年Schwarz研究确定硒是人和动物必需的营养元素。1973年，Rotruek等人发现硒是高等动物生物代谢不可缺少的谷胱甘肽过氧化物酶的活性组分。同年，硒被世界卫生组织认定是人体必需的微量元素。此后大量的研究表明，硒的营养范围十分狭窄。人体食物中硒含量少于0.05mg/kg就会造成缺硒，大于5mg/kg又会产生中毒。硒在地球上分布不均匀，出现了部分高硒地区和严重缺硒地带。中国72％地区处于缺硒、低硒带，膳食中硒摄入量的不足严重影响着几亿人口的身体健康。根据中国营养学会调查报告，成人每日的硒摄入量仅为26.63ug,距中国营养学会和国际硒学会推荐日摄入量50ug相差甚远。缺硒会引起人类的克山病、大骨节病、癌症、糖尿病、心脑血管病、不育症等疾病，而适当的补硒可以防癌、抗肿瘤、抗爱滋病和抗衰老。
缺硒已严重威胁着人们的身体健康并造成潜在危害。近年来，随着人们越来越注重保 健和养生，各种富硒产品应运而生，但是产品质量参差不齐，硒的含量没有一个统一的标 准。并且由于土壤中硒含量的不均，富硒产品在种植过程中都采用喷洒无机硒(硒酸钠、亚 硒酸钠)来提高产品中硒的含量。但是无机硒(硒酸钠、亚硒酸钠)毒性大，被列为第六类剧 毒物质，无机硒的使用严重危害了环境和人类健康。因此，现在首要研究任务是开发一种高 性能低毒性的硒源，这将是硒营养保健研究的重点 [0003] 开始研究制备高活性低毒性的含硒化合物，目前这方面的研究进展比较缓慢。传 统意义上包括两种形式的硒：一是兼有活性和毒性的硒化合物，二是毒性低的零价硒。其中 零价硒主要存在灰色、红色和黑色三种形态，对于这三种形态的元素硒来说，我们所熟知的 灰色和黑色硒粒径大，且没有生物活性，而纳米级红色硒具有生物活性，根据急性毒性 (LD 50 )数据显示，无机硒LD 50 ＝15mg/kg，有机硒LD 50 ＝30‑40mg/kg，纳米硒LD 50 ＝113mg/kg。 迄今，纳米硒是已发现毒性最低的。目前纳米硒的生产方法主要有化学合成法和生物合成 法，生物的纳米硒比化学合成的纳米硒更均匀，形态更规则，且生物合成的纳米硒耐高温， 更稳定，不易转化成黑色或褐色纳米硒。
生物合成纳米硒主要利用微生物还原亚硒酸盐产 生，随着研究的不断深入，能够合成纳米硒的微生物涵盖的种属极其丰富，超过30个属，包 括大肠杆菌(Escherichia coli)、荚膜红细菌(Rhodobacter Imhoff)、枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)等。但是由于大多数微生物不易发酵生产、不易保存的特性，不能实 现工业化生产。芽孢杆菌由于能产生抗逆性比较强的芽孢，能耐生产加工过程中的不良环 境和条件，加上易于保存，是工业化生产纳米硒的良好微生物菌种。但是由于各种因素，导 致产生的微生物纳米硒颗粒粒径较大，且大小不一。 CN107881127 发明内容[0004] 本发明的目的是提供一种解淀粉芽孢杆菌Lxz‑41，该解淀粉芽孢杆菌具有可控制 备纳米硒的能力。 [0005] 本发明采用的技术方案是： [0006] 一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Lxz‑41，保藏编号为：CCTCC M2016578，保藏在中国典型培养物保藏中心，该菌株具有可控生产纳米硒的能力。 [0007] 一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Lxz‑41可控生产纳米硒的 方法，包含以下步骤: [0008] S1 .菌种活化：将保藏菌株接于牛肉膏蛋白胨或LB试管琼脂斜面培养基上，25‑40 静止培养活化，待菌落长满斜面； [0009] S2.种子培养：将斜面培养菌种接种于含有硒盐的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，装 液量为容器容量的20％，25‑40、80‑200r/min振荡培养12‑24h，得种子液； [0010] S3.纳米硒可控生产：将种子培养液按照1％‑5％接种量接种至装有发酵培养基的 发酵容器中，所述发酵培养基中包括硒盐，硒盐采用流加形式加入，发酵培养基装液量为发 酵容器的40％‑70％，搅拌速率50‑200r/min、通气量0.5‑2.0vvm，温度保持25‑40，发酵时 间24‑72h； [0011] S4.纳米硒提取纯化：发酵液下罐，4000‑10000r/min4冷冻离心10‑20min，收集 得到菌体，用约1/4发酵液体积无菌生理盐水冲洗三次，用约1/20体积无菌蒸馏水进行悬 浮，进行冰浴超声破壁20‑40min，菌体裂解液4000‑10000r/min4冷冻离心10‑20min，沉淀 用同体积去离子水清洗三次，并用约1/2体积蒸馏水悬浮，得到纳米硒悬液，加入同体积氯 仿进行萃取30min，萃取2‑3次，合并下层水相，用均质机均质2‑5min，4000‑10000r/min4 冷冻离心10‑20min，沉淀用等体积无菌生理盐水清洗3次，冷冻干燥即得微生物纳米硒。
[0012] 进一步的，S2中牛肉膏蛋白胨液体培养基中的硒盐为亚硒酸盐、硒酸盐中的一种 或几种，质量体积比为100‑500mg/L。 [0013] 对S2、S3培养基中的硒盐进行单独灭菌，然后加入到灭菌后的培养基中。 [0014] 进一步的，S3中发酵培养基组分为(g/L)：葡萄糖10，蛋白胨5，硫酸铵1，七水硫酸 .5，表面活性剂0.5‑1，pH＝ 7.2‑7.4。 [0015] 进一步的，S3中发酵培养基中的硒盐用母液分批流加形式或连续流加形式，以控
