最新补硒机制（最新补硒机制）

背景：

硒是一种人体必需的微量元素，主要通过硒蛋白发挥抗氧化、调节免疫及生殖系统等作用。硒缺乏可引起疾病的发生，克山病（Keshandisease,KD）病因至今尚不明确，但环境低硒是最主要的危险因素之一，且补硒能够有效预防KD的发生，近年来KD被广泛认为是一种环境与其应答基因共同作用的复杂性疾病。本课题组长期从事关于KD线粒体损伤的机制研究，前期研究通过比对KD患者与正常对照外周血单核细胞线粒体功能相关基因表达谱，发现一氧化氮（nitricoxide,NO）相关一氧化氮合酶（nitricoxidesynthase,NOS）基因表达显著上调。经KD相关文献调研发现KD患者血清NO水平及NO相关蛋白诱导性一氧化氮合酶（induciblenitricoxidesynthase，iNOS）表达均高于正常对照，NO可能作为一种中间环节参与KD的发病。那么，高浓度的NO对心肌细胞是否具有损伤作用，值得进一步研究。因此本课题通过细胞学实验探索高NO浓度对心肌细胞的作用，并且加硒预处理细胞，探索硒在高浓度NO作用心肌细胞过程中的作用，为KD发病机制研究提供新的科学依据。

目的：

1）构建高NO浓度的心肌细胞模型，检测NO及iNOS表达水平；

2）加硒预处理细胞，比较加硒组与不加硒组ROS、ΔΨm、NO及凋亡相关指标的差异以探讨硒对高浓度NO造成的心肌细胞损伤的保护机制。

方法：

1）高浓度NO心肌细胞损伤模型的建立：以细胞因子TNF-α作为内源性NO诱导物，硝普纳（sodiumnitroprusside,SNP）作为外源性NO供体，建立高浓度NO的心肌细胞模型；

2）硒预处理心肌细胞的方法：培养AC16心肌细胞，待细胞长满后，给细胞更换亚硒酸钠和培养基配制的补硒培养液，硒的终浓度为100ng/mL，预处理4h；

3）干预后相关指标的检测方法：CCK-8检测不同浓度TNF-α和SNP干预心肌细胞后的生存率，选择适宜浓度进行后续实验；根据不同处理措施将心肌细胞分组，包括：（1）对照组：不加任何干预；（2）补硒组：细胞贴壁后换配制的补硒培养基，硒的终浓度为100ng/mL；（3）TNF-α组：培养基中加入TNF-α；（4）硒+TNF-α组：细胞贴壁后换配制的补硒培养基，预处理4h后加入TNF-α；（5）SNP组：培养基中加入SNP；（6）硒+SNP组：细胞贴壁后换配制的补硒培养基，预处理4h后加入SNP；Griess法检测生成NO的量，酶标仪检测iNOS的相对活性；流式细胞仪检测活性氧水平，荧光显微镜检测细胞膜电位变化情况及细胞凋亡状况；qRT-PCR检测凋亡相关因子及iNOSmRNA表达水平，Westernblotting分析Bax、Bcl-2、iNOS及NF-κB相关蛋白的表达水平。

4）采用SPSS18.0软件进行实验数据分析，计量资料采取t检验或方差分析，计数资料采用卡方检验。

结果：

1）CCK-8检测各组细胞活性，随着TNF-α和SNP浓度的增加，细胞活性呈降低趋势，且差别有统计学意义（P＜0.05）；分别对TNF-α组和硒+TNF-α组及SNP组和硒+SNP组细胞活性进行两两比较，结果发现有硒处理细胞活性均较高，且差别有统计学意义（P＜0.05）。

2）TNF-α和SNP干预AC16心肌细胞后能显著增加细胞内的活性氧含量；TNF-α组和硒+TNF-α组比较、SNP组和硒+SNP组比较，结果发现硒能减弱TNF-α和SNP诱导生成细胞内活性氧量。

3）TNF-α和SNP干预后AC16心肌细胞线粒体膜电位降低；硒+TNF-α组比TNF-α组膜电位高，硒+SNP组比SNP组膜电位高，加硒预处理组的红色荧光较强。硒能维持心肌细胞线粒体膜电位。

4）与对照组比较TNF-α和SNP组细胞核固缩比例显著升高，硒预处理能降低细胞核固缩比例。同时，采用qRT-PCR和Westernblotting检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达情况，结果表明与对照组比较，在mRNA和蛋白水平TNF-α和SNP能够显著增加Bax，但降低Bcl-2的表达。分别比较TNF-α组和硒+TNF-α组及SNP组和硒+SNP组，结果发现加硒处理能使Bax表达降低，Bcl-2表达升高，表明硒预处理对细胞有保护作用。

5）检测细胞iNOS的活性及培养基NO含量，与对照组比较TNF-α50ng/mL组iNOS活性和NO含量均升高但差别无统计学意义，而TNF-α100ng/mL组iNOS活性和NO含量升高且差别有统计学意义（P＜0.05）。TNF-α100ng/mL组，硒预处理能显著减弱iNOS的活性和NO生成量，差别有统计学意义（P＜0.05）。相比对照组，SNP组NO含量显著增加，而硒预处理能减少NO生成量。

6）采用qRT-PCR和Westernblotting检测iNOSmRNA和蛋白表达水平。结果表明，对照组和SNP组iNOS表达量较低，而TNF-α组iNOS在mRNA和蛋白水平表达均较高，硒预处理可减少iNOS的表达，TNF-α组和硒+TNF-α组比较差别有统计学意义（P＜0.05）。

7）通过Westernblotting检测NF-κBp65、p-IκBα和IκBα蛋白质含量。结果表明，TNF-α组与对照组比较，TNF-α组p-IκBα表达水平显著增加，而IκBα减少，p65基本不变。TNF-α组和硒+TNF-α组比较，硒预处理组p-IκBα水平减少，而IκBα增加。相比对照组和硒预处理组，SNP组中NF-κBp65、p-IκBα和IκBα蛋白含量差别均无统计学意义。

结论：

1）高浓度NO能引起心肌细胞发生凋亡，硒对高浓度NO造成心肌细胞损伤有保护作用。

2）TNF-α和SNP干预AC16心肌细胞，均能诱导生成大量ROS，引起心肌细胞线粒体膜电位降低，而硒预处理能够减弱TNF-α和SNP对细胞造成的氧化损伤。

3）在TNF-α干预AC16心肌细胞中，硒的保护作用至少部分通过抑制NF-κB活化实现。

4）在SNP干预AC16心肌细胞中，硒的保护作用主要通过其抗氧化特性体现。

关键词：克山病；一氧化氮；硒；细胞凋亡

论文类型：应用基础